生物化学第二章蛋白质资料.ppt

4 蛋白质的变性 定义: 天然蛋白质受物理或化学因素的影响，其共价键不变，但分子内部原有的高度规律性的空间排列发生变化，致使其原有性质发生部分或全部丧失，称为蛋白质的变性(denaturation) 。 实质: 次级键断裂，空间结构破坏。 (变性蛋白质分子互相凝集为固体的现象称凝固) 蛋白质的变性 蛋白质变性后的表现 生物活性丧失；溶解度降低，对于球状蛋白粘度增加；生化反应易进行；光吸收系数增大；组分和分子量不变。 物理因素： 高温、高压、震荡、紫外线、电离辐射、 超声波等。 化学因素： 强酸、强碱、有机溶剂、重金属盐等。 引起蛋白质变性的主要因素 蛋白质的复性 定义： 当变性因素除去后，变性蛋白质又可恢复到天然构象，这一现象称为蛋白质的复性（renaturation）。 蛋白质变性的利用： 医疗方面；食品方面；蛋白质制备；酶制剂保存等。 (有些蛋白质的变性作用是可逆的，其变性如不超过一定限度，经适当处理后，可重新变为天然蛋白质) 反应名称 试 剂 颜色 反应有关基团 有此反应的蛋白质或氨基酸 双缩脲反应 NaOH、CuSO2 紫色或粉红色 二个以上肽键 所有蛋白质 米伦反应 HgNO3、Hg(NO3)2及HNO3混合物 红色 ? Tyr 黄色反应 浓HNO3及NH3 黄色、橘色 ? Tyr、Phe 乙醛酸反应 (Hopking-Cole反应) 乙醛酸试剂及浓H2SO4 紫色 ? Trp 坂口反应 (Sakaguchi反应) α-萘酚、NaClO 红色 胍基 Arg 酚试剂反应 (Folin-Cioculteu反应) 碱性CuSO4及磷钨酸-钼酸 蓝色 酚基、吲哚基 Tyr 茚三酮反应 茚三酮 蓝色 自由氨基及羧基 α-氨基酸 ? 5 蛋白质的颜色反应 —OH N 6 蛋白质的紫外吸收 大部分蛋白质均含有带芳香环的苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸。 这三种氨基酸的在280nm 附近有最大吸收。因此，大多数蛋白质在280nm 附近显示强的吸收。 利用这个性质，可以对蛋白质进行定性鉴定和定量测定。 7 蛋白质的分离和纯化 主要是利用蛋白质之间各种特性的差异，包括蛋白质分子的酸碱性质、分子的大小和形状、溶解度、吸附性质和对配体分子的特异亲合力等。 蛋白质纯化的目标: 增加制品的纯度，即设法除去变性的和不需要的蛋白质以增加单位蛋白质重量中所需蛋白质的含量或生物活性。 分离纯化蛋白质的程序为：前处理（细胞或组织处理）、粗分级分离（除去杂蛋白）和细分级分离。 分子大小 透析和超过滤：透析指利用蛋白质分子不能通过半透膜而与小分子分离；超滤是利用压力或离心力使小分子溶质通过半透膜而蛋白质被截留在膜上而分离。 密度梯度离心：蛋白质颗粒在具有密度梯度的介质中离心时，质量和密度大的颗粒比质量和密度小的颗粒沉降得快，且每种蛋白质颗粒沉降到与其自身密度相等的介质密度梯度时，即停止不前，最后各种蛋白质在离心管中被分离成不同的区带。 凝胶过滤：即分子排阻层析。凝胶颗粒内部为多孔的网状结构。大分子最先流出层析柱。 等电点沉淀和pH控制 盐溶和盐析：中性盐在低浓度时可增加蛋白质的溶解度，即盐溶。原因是蛋白质分子吸附盐类离子后，带电层使蛋白质分子彼此排斥，而与水分子相互作用加强；当离子强度增大到足够高时，此时与蛋白质疏水基团接触的自由水被移去以溶剂化盐离子，导致蛋白质疏水基团暴露，使蛋白质因疏水作用凝聚沉淀。 有机溶剂分级分离法：一是降低介质的介电常数，二是与蛋白质争夺水化水。 温度沉淀：温度对溶解度有影响，低温稳定，高温不稳定。在0~40℃，大部分的球状蛋白质溶解度随温度升高而增加。 溶解度 电荷 电泳（净电荷、分子大小、形状） 区带电泳 聚丙烯酰氨凝胶电泳（PAGE） 毛细管电泳 离子交换层析：是根据蛋白质所带电荷的不同进行分离纯化。常用的阳离子交换剂为羧甲基纤维素（CM-C），阴离子交换剂为二乙氨基乙基纤维素（DEAE-C）。 等电聚焦：外加电场时，蛋白质混合物在具有pH梯度的介质中移向并聚焦（停留）在等于其等电点的pH处，形成区带。 层析聚焦：层析柱中建立连续的pH梯度，蛋白质样品由柱上端随缓冲液的展开而聚焦在各自的等电点pH处，形成区段。 吸附：吸附层析，吸附剂（硅石、氧化铝、活性碳）和疏水吸附剂，与待分离分子和杂质分子的吸附与解吸能力不同。 特异亲和力：亲和层析——这是根据蛋白质能与特异的配体相结合而设计的一种方法。 其它：如高效液相层析（HPLC）,快速蛋白液相层析（FPLC） 蛋白质 ＋ 配体 蛋白质配体复合物 附A: 蛋白质含量测定与纯度鉴定： 测定蛋白质含量的常用方法：