非无菌制剂的微生物限度检查法微生物计数法.doc

〈61〉非无菌制剂的微生物限度检查法:微生物计数法 引言 本检查法可用于需氧条件下生长的嗜温细菌和真菌的计数。 本检查法主要用于确定原料或制剂是否符合相应的微生物限度标准。当用于此项检查时,按下述规定进行检验,包括样品的取样量和结果的判断。 本检查法不适用于以活的微生物作为活性成分制剂的微生物限度检查。 本检查法可用其他微生物检查方法替代,包括自动检测方法,但必须证明替代方法等效于药典检验方法。 -般程序 本检查应在避免外来微生物污染供试品的试验条件下进行,防止微生物污染的措施不得影响供试品中污染微生物的检出。 如果供试品具有抗菌活性,应尽可能去除或中和,为此目的使用的灭活剂需证明其有效性及对微生物的无毒性。 如果供试液制备时使用了表面活性剂,应验证其对微生物无毒性以及与灭活剂的相容性。 计数方法 计数方法可采用薄膜过滤法或平皿计数法中的一种。通常最大可能数(MPN)法用于微生物计数精确度较低；但对于生物负荷很低的样品,MPN法可能是最适合的法。 计数方法的选择基于供试品的特性和微生物限度的要求等因素。应通过足够的样本量通过试验来判断选用的方法是否符合规定,其适用性也需被验证。 促生长试验、计数方法的适用性确认试验和阴性对照试验 总则 供试品中污染的微生物计数方法的适用性应进行确认。 如果检验条件或供试品发生改变可能影响检验结果时,计数方法的适用性应重新进行确认。 试验菌的制备 试验菌液可用标化的稳定菌悬液或如下所述来制备。使用适宜的菌种保藏技术(种子批系统)确保菌种的活力,从主种子库中取出接种的原始试验菌株的传代次数不得超过5代(从菌种保藏中心获得的菌种为第0代),各细菌和真菌的试验菌株培养见表1。 使用pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液或pH7.2磷酸盐缓冲液制各试验用菌悬液,黑曲霉孢子悬液的制备可用含0.05%的聚山梨酯80的缓冲液。菌悬液应在2小时内使用,保存在2~8℃ 下的菌悬液可在24小时内使用。适宜体积的黑曲霉和枯草芽孢杆菌稳定的孢子悬液,可替代制备并稀释好的新鲜营养体细胞悬液,用于进行试验接种。稳定的孢子悬液可保存在2~8℃ 下,在验证过的贮存期内使用。 表1 试验菌的制备和使用 试验菌株 试验菌的制备 培养基促生产试验 供试品计数方法的适用性试验 总需氧菌细菌数测定 总酵母菌和霉菌数测定 总需氧细菌数测定 总酵母菌和霉菌数测定 金黄色葡萄球菌ATCC 6538 NCIMB 9518 CIP 4.83 NBRC 13276 胰蛋白大豆琼脂或胰蛋白大豆肉汤 30~35℃ 18~24小时 胰蛋白大豆琼脂或胰蛋白大豆肉汤 ≤100 cfu 30~35℃ ≤3天 胰蛋白大豆琼脂/MPN胰蛋白大豆肉汤 ≤100 cfu 30~35℃ ≤3天 铜绿假单胞菌ATCC 9027 NCIMB 8626 CIP 82.118 NBRC 13275 胰蛋白大豆琼脂或胰蛋白大豆肉汤 30~35℃ 18~24小时 胰蛋白大豆琼脂或胰蛋白大豆肉汤 ≤100 cfu 30~35℃ ≤3天 胰蛋白大豆琼脂/MPN胰蛋白大豆肉汤 ≤100 cfu 30~35℃ ≤3天 枯草芽孢杆菌ATCC 6633 NCIMB 8054 CIP 52.62 NBRC 3134 胰蛋白大豆琼脂或胰蛋白大豆肉汤 30~35℃ 18~24小时 胰蛋白大豆琼脂或胰蛋白大豆肉汤 ≤100 cfu 30~35℃ ≤3天 胰蛋白大豆琼脂/MPN胰蛋白大豆肉汤 ≤100 cfu 30~35℃ ≤3天 白色念珠菌 ATCC 10231 NCIMB 3179 IP 48.72 NBRC 1594 沙氏葡萄糖琼脂或沙氏葡萄糖肉汤 20~25℃ 2~3d 胰蛋白大豆琼脂 ≤100 cfu 30~35℃ ≤5天 沙氏葡萄糖琼脂 ≤100 cfu 20~25℃ ≤5天 胰蛋白大豆琼脂 ≤100 cfu 30~35℃ ≤5天 不采用MPN法 沙氏葡萄糖琼脂 ≤100 cfu 20~25℃ ≤5天 黑曲霉 ATCC 16404 IMI 149007 IP 1431.83 NBRC 9455 沙氏葡萄糖琼脂或沙氏葡萄糖肉汤 20~25℃ 5~7天或直到形成成熟的孢子 胰蛋白大豆琼脂 ≤100 cfu 30~35℃ ≤5天 沙氏葡萄糖琼脂 ≤100 cfu 20~25℃ ≤5天 胰蛋白大豆琼脂 ≤100 cfu 30~35℃ ≤5天 不采用MPN法 沙氏葡萄糖琼脂 ≤100 cfu 20~25℃ ≤5天 阴性对照试验 为了确认试验条件是否符合要求，应以稀释剂替代公事业进行阴性对照试验，阴性对照应无菌生长。供试品检查时也需进行阴性对照，如果阴性对照有菌生产，则需要调查