回收连接转化克隆测序.docVIP

连接: 目标片断回收后立即与pGEM-T载体做连接反应。反应体系：2X连接buffer 5μl，回收产物 3μl，T载体 1μl，T4连接酶 1μl，共10μl；混匀，4℃放置16小时以上 转化: 1、从-70℃冰箱中取40μl感受态细胞悬液,冰上解冻。 2、 加入连接产物1-2μl (含量不超过50ng,体积不超过10μl),轻轻弹匀,冰上放置25分钟后。（38μl ddH2O+20μl KCM+50μl感受态）。 3、42℃水浴中热击45秒,热击后迅速置于冰上冷却2分钟。 4、向管中加入0.6ml LB液体培养基(不含Amp),混匀后37℃振荡培养1小时,使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因(Ampr )。 5、在加有氨苄的琼脂糖平板上预加40μl的X-gal和4μl的IPTG，推棒涂匀，放置10min让其充分吸收 6、将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含Amp的筛选平板上,正面向上放置半小时,待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养16-24小时。 7. 培养12小时后，挑选圆润的菌落转入另一个预加有40μl X-gal和4μl IPTG并划分不同区域的平板上，37℃培养8小时。 阳性克隆的鉴定: 做菌落PCR挑选阳性克隆:在反应管中加入8μl无菌水，挑选单个菌落入管中，加10μl矿物油封住液面，95℃反应5min。结束后在每管中加入除模板外的其他反应体系，用量与反应条件与扩增相同。挑选电泳结果好的测序。 注意事项 同时做两个对照: 对照组1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。 对照组2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。 ： 1.将感受态细胞加入要转化的东东（一般原则是转化物体积不超过感受态细胞体积的十分之一）。冰上置半小时。 2.热休克：42度，时间30秒至120秒都可以。一般书上都是90秒。 3.复苏：热休克后加入4倍体积的无抗生素培养基SOC（如果嫌麻烦，LB也可），37度摇一小时。转速最好低于220转/分钟。 4.涂板：4000转离心2－3分钟，多余上清不要，留约200UL将菌液混匀，推平板，直到菌液基本涂干。37度孵箱放12－16小时。