基因工程的工具酶概要1.pptVIP

Taq DNA聚合酶是从栖热水生菌(Thermus aquaticus)中分离纯化的依赖DNA的DNA聚合酶，最适温度75℃-80℃ 需要Mg2+(10 mmol／L)，在低浓度Mn2+(2 mmol/L)中有低活性，Ca2+使其完全失活，一价阳离子高至0.1 moI／L对活性无影响，而最适浓度NaCl为40 mmol/L，KCl为60 mmol/L 最适pH7.8(Tris-HCl)，与大肠杆菌DNA聚合酶相比，其最大特性是耐高温和无核酸酶活性 Taq DNA聚合酶 催化RNA体外合成反应 依赖 DNA 的 RNA 聚合酶 不依赖 DNA 的RNA聚合酶 RNA聚合酶 反转录酶(reverse transcriptase) 　 反转录酶具有5′→3′的DNA聚合酶活性，以RNA为模板聚合cDNA链,同时又具有3′ →5′和5′ →3′的 RNA 外切核酸酶活性。AMV和MLV。 主要用途：转录 mRNA 成为 cDNA 制备基因片段 双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链 DNA 和 RNA的修饰酶 核酸酶SI 碱性磷酸酶 磷酸激酶 末端脱氧核苷酸转移酶 甲基化酶 1）单链核酸酶SI 功能： 降解 ssDNA 或 ssRNA 形成 5’-磷酸末端的单或寡核苷酸片段。 应用： 分析DNA：RNA杂交体结构（S1 mapping）。确定内含子部位。 切除DNA片段上的单链末端，形成平末端. 切开 cDNA 合成过程中形成的发夹环 在限制酶位点上产生小缺失 Rnase 和 DNase RNase-Free DNase 是一种DNase I（核酸内切酶）， 可以降解双链或单链 DNA。 RNase H： 特异性地水解杂交到 DNA 链上的 RNA磷酸二酯键，故能分解RNA/DNA杂交体系中的RNA链。该酶不能消化单链或双链DNA。 RNase A：广泛应用的核酸内切酶。对RNA有水解作用，但对DNA则不起作用。 Rnase 酶非常稳定，常规的高温高压蒸气灭菌方法和蛋白抑制剂都不能使RNase完全失活。 DEPC 处理。 碱性磷酸酶 功能：催化去除 DNA、RNA 上的 5’ 端磷酸基团, 从DNA片段上除去5’磷酸以防自身连接。 用途：在DNA连接之前常用它处理克隆载体以防止载体自身连接。 Calf Intestinal Alkaline Phosphatase (CIAP) 磷酸激酶 T4-多核苷酸磷酸激酶 末端脱氧核苷酸转移酶 功能：在一定条件下，催化将一个一个的脱氧核苷酸，沿着5’到 3’加到 DNA 链的 3’-OH 末端。该过程不需要DNA模板，对双链、单链 DNA 都适用。经常用于人工粘性末端的构建。 末端脱氧核苷酰转移酶(TDT) 甲基化酶 原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护宿主 DNA 不被相应的限制酶所切割。 Dam 甲基化酶可在 GAmTC 序列中的腺嘌呤 N6 位置上引入甲基。受其影响的酶有Bccll II、MbbooII等。 Dcm 甲基化酶识别 CCmAGG 或 CCmTGG 序列，在第二个胞嘧啶 C 的 C5 位置上引入甲基。受其影响的酶有EccooR IIII等 孙乃恩 分子遗传学 第152页 孙乃恩 第152页 同裂酶（isoschizomers)来源不同的限制酶识别同样的核甘酸序列，切割方式相同或不相同。 同尾酶(isocaudamer)来源不同，识别的靶序列也不同，但切割后产生相同的粘性末端。BamHI, BclI,BglII,Sau3AI,XhoII是一组同尾酶 * * * * * * * * * * * * * * 同裂酶 5`---GGATCC---3` 3`---CCTAGG---5` 5`---G GATC C---3` 3`---C CTAG G---5` 5`---AGATCT---3` 3`---TCTAGA---5` 5`---A GATC T---3` 3`---T CTAG A---5` Bgl II Bam HⅠ 同尾酶 杂合位点（hybrid site)：由一对同尾酶分别产生的粘性末端共价结合形成的位点。杂合位点一般不能再被原来的任何一种同尾酶所识别。 同尾酶 MunI： 5` - C A A T T G - 3` 3` - G T T A A C - 5` EcoRI： 5` - G A A T T C - 3` 3` - C T T A A G - 5` 5` - G