狂犬病毒双G基因HEPFlury株的拯救论文.pdfVIP

346 第五届博士生学术年会论文集 狂犬病毒双G基因HEP—Flury株的拯救① 刘晓慧 艾 军 郭霄峰 孙京臣 陈 晶 华南农业大学兽医学院微生物教研室，广东省广州市，510642 7一N—P—M—G—L一5 摘 要 本研究在狂犬病毒HEP-Flury株全基因组3 7的伪基因 区域(G与I。之间)插入一个G基因，构建出携带双G基因的全长感染性克隆，其与辅助质粒 dG嵌舍病毒，盲传十代，用荧光抗体和RT— 共转染BHK～21细胞，获得狂犬病毒HEP—Flury PCR鉴定，结果表明，该嵌合病毒稳定生长，该研究为开发新型基因工程疫苗奠定基础。 双G基因 关键词 狂犬病毒 反向遗传系统HEP—Flury株 狂犬病是由狂犬病毒引起的一种人畜共患病，病死率几乎高达100％。该病流行于100多个国家 和地区，全世界每年因狂犬病死亡的人数达55000人，印度是狂犬病流行最严重的国家，其死亡人数占 一半；中国的狂犬病例数仅次于印度，占世界第二位。目前，对狂犬病尚无有效的治疗方法，及时接种疫 苗是预防狂犬病的最有效措施之一，因此，疫苗株的选择是狂犬病控制的有效因素之一。 为了研究一种新型的狂犬病弱毒活疫苗，国内外学者利用反向遗传操作系统在基因重排和缺失P 基因方面进行了探索和研究。研究发现，基因发生重排的病毒接种小白鼠后，机体的免疫水平并没有降 低。Flanagan等报道，如与狂犬病毒同属于弹状病毒科，基因结构十分相似的水泡性口膜炎病毒将G 基因从基因组的第四位重排至离病毒启动子较近的位置，G基因重排的病毒将大大增强接种鼠的免疫 水平。Junji等的研究表明，在弱毒狂犬病毒rRC—HL的pI，基因问增加一个G基因的开放阅读框，获 相似，紫外灭活的病毒与rRC～HL相比，能明显地提高机体抗体的产生，因此增加弱毒株糖蛋白的表达 量，能够提高机体的免疫力。 鉴于此，本研究用弱毒株HEP-Flury株在其pL基因间增加一个G基因的开放阅读框，获得双G 的拯救病毒HEP-dG株，为研制高效、安全的具自主知识产权的狂犬病病毒基因工程口服疫苗提供了 良好的疫苗候选株。 一、材料与方法 (一)材料 1．质粒 全基因组)由日本国立传染病研究所Morimoto教授惠赠。 ①基金项目：教育部博士点基金(20060564002)；广东省动物防疫检疫研究专项经费粤农。 农业与林业 2酶粪厦其他相关试剂 RNA提取试剂Trizol Kit和 聚合酶、dNTPs购自北京天为时代生物工程公司；凝胶回收试剂盒购自OMEGA公司；Plasmid Transfeetion Superfect Reagent购自Qiagen公刊。 3自胞厦细胞培养相差试剂 仓鼠肾(BHK21)细胞，购自武汉生物制品所基因工程室。 小牛血清．购自广州展辰生物公司；DMEM购自广州英韦创津生物公司。 (二)方法 dG 1构建舍有ⅢG基目的征虫病毒垒长基目组质粒pHEP TAcGAT(，(；TTCCTCAGGlIC 增出舍有托犬病毒G基因的完整开放阅读框的片段，两端添加PstI和BsiW]酶切位点。分别用双酶酶 3 切pHEP 0和PCR产物回收．连接，转化TOPl0感受态，筛选阳性质籼，酶切、洲序鉴定．命名为 PHEPdG。 圈1 古自Ⅲ(，#目∞＆女镕毒±*i目m质粒pHEP-dG的构建 2重组病毒的拯救 征犬病毒IIEI。dG株的拯救参照Inoue等和郭宵峰等的方法进行。 3 HEP dG病毒的传代 将拯救的HE