犬瘟热病毒DNA疫苗的实验免疫研究论文.pdfVIP

犬瘟热病毒DNA疫苗的实验免疫研究 邱薇1范泉水1李作生1郑颖1 杨美峰1尹惠琼1王双印1夏咸杜2 1成都军区联勤部军事医学研究所 2军事医学科学院军事兽医研究所 犬瘟热病毒(c日11itH也t衄甲e而nm，CDV)属于副粘病毒科麻疹病毒属中的病毒，在世界上 广泛分布，是当前对养犬业、毛皮动物养殖业和野生动物保护业盘害最大的犬瘟热(ca碰。 4htemp“，CD)病原，该病发病率和死亡率都较高。CDV最初只感染犬，但近年来其自然感染 的动物范围又不断扩大的趋势，能使许多野生动物和家养的动物发病[1,21。CDV有众多的 自然感染宿主，又能在大量的不相关动物种类中交叉感染，因存在种问传播，要消灭CDV是 不容易的，其危害越来越大。犬瘟热的预防免疫主要是通过接种弱毒疫苗进行工动免疫。 无论足进口疫苗还是其复制品或国内生产的疫苗，虽然有一定的效果，但都不能彻底控制 CD的发生。而且现行的弱毒疫苗只有在幼犬体内的母源抗体完全消失后才能产生有效保 护作用，但对某些动物来说弱毒苗的毒力仍然可引起致死性的感染，这对保护稀有动物来 说是个难题。 质粒DNA的肌肉内接种及其编码蛋白的后续表达为预防接种和基因治疗开辟了新的 途径，我们正研究用DNA疫苗来预防CDV的可能性。C．DV的H蛋白是诱导机体产生中和 抗体的主要蛋白之一，是抗CDV免疫的重要抗原，抗CDVH蛋白单壳隆抗体(McAb)只有中 利病毒活性，对实验鼠的保护率强于抗F蛋白的McAbl61。我们用真核表达载体构建了 CDV感染产生一定程度的保护。 l材料与方法 体由本实验室保存。DNA胶回收试剂盒购自上海华舜生物工程有限公司。大肠杆菌脚 感受态细胞由本实验室制备。猴，旨(vet0)细胞、CDV毒种由本实验室保存。5只混合饲养 的CDV中和抗体效价≤2的昆明犬为市售。 1．2引物由上海生工合成，序列如下ATCrAGATC．GACCTCAGGG一3’。Pl5’一AAATCC． TATGTGAGA一3’：P25 1．3 (Wo)细胞，培养5天后，细胞出现典型的CDV细胞病变，弃上清液，用浓缩，用病毒RNA提 取试剂盒提取RNA，操作按说明书进行。纯化的RNA部分用RT--PCR试剂盒进行RT— PCR，其余了—20℃冻存备川。P(噩产物在0．8％琼脂糖凝胶上进行电泳。 1．4目的片段的回收及克隆PCR产物电泳后用胶回收试剂盒回收约1．9kb的日的片 段，与丁载体连接，转化大肠杆菌YMl09感受态细胞，涂布含50∥ml氨苄青霉素的LB平 板，37E培养过夜，挑取单个菌落培养后抽提质粒并进行酶切鉴定，挑选反向插人的重组质 粒pT℃Dv—Ho 203 1．5免疫质粒的构建和序列测定重组质粒pTCDV—H用HtndlⅡ酶切，再用KIe∞w补 平，然斤用BamHI将H片段切下，经胶回收纯化H片段，再与用BaraHl／200RV双酶切的 50w，IIll氨苄青霉素的LB平板，37℃培养过夜，挑取单个菌落培养后抽提质粒并进行酶切 鉴定，阳性重绗质粒命名为pu地DV—H。重组质粒由上海华舜生物工程有限公司进行核苷 酸序列侧定，并与＆nB8nk中的H基因序列进行比较。 800 u印lR鹤的磷酸盐缓冲液(PBS，0．0067M，PH7，2)，所有按种分别在左、心肢股四头肌处肌 注。每隔8周在同样部位接种同样剂量的DNA。共接种3次，每次接种前采血样检测效价。 1．7抗体分析以纯化的C,DVIgG为阳性对照，用ELISA测定抗CDVH蛋白抗体滴度． 推测山待检血清的中和抗体(SN)效价。 1．8攻毒为检测CDV H诱导的保护水平，在第三次接种4周后，用剂量为1X107’o 1℃尬_∥只的CDV神经株强毒。对全部实验犬进行攻毒实验，每天观察犬的发病情况，7天及 14天时采盎，检测血清效价。 2结果 2．1免疫质粒的构建用0．8％琼脂糖凝胶电泳，扩增片段约为1．9髓，与理论值大小一 —致。筛选到的重组质粒plRCDVH甩BamHI酶切鉴定，用0．8％琼脂糖凝胶电泳，得到约 7．2Kb的正狮质粒片段，与预期太小相符(图1)。 l 2 3 4 5 1、H基因的PCR产蚜；2、重组质粒plB