PEI介导eNOS和vegf基因联合体内转染对慢性缺氧诱导小鼠肺动脉高压作用的实验研究.pdfVIP

贵阳医学院 2014 届硕士研究生论文 引言 肺动脉高压（Pulmonary arterial hypertension，PAH）是一种致命性疾病，在 2008 年第四次PAH 会议上,确定只以静息状态下右心导管测定的肺动脉平均压 ≥25 mm Hg作为诊断标准。以肺血管重构为特征，其主要病理变化为血管内皮细 胞异常增殖、平滑肌细胞肥大、内膜增厚等，最终导致肺血管阻力增加，肺动脉 压升高。这种疾病通常因肺血管阻力增大、通气血流比例失调及右心功能失代偿 至心肺功能衰竭而引起早期死亡【1】。其常见的治疗措施是以药物治疗为主， 血管扩张剂、钙拮抗剂的使用，以及NO的吸入、抗增殖药物的干预等，通过扩张 血管，抑制平滑肌增殖、诱导凋亡作用，起到一定的缓解PAH的效果，但是不能 从根本上扭转肺血管重构这一PAH发生的基本病理生理变化。如何阻止及逆转肺 血管重构,已被认为是有效防治PAH的关键环节。随着分子生物学和细胞技术的兴 起，基因治疗和细胞治疗已被认为是PAH的重要治疗手段。 聚乙烯亚胺（polyethyleneimine，PEI）是一种能够介导寡核苷酸和质粒DNA 进行体内和体外转染的阳离子聚合物，Boussif等 【2】在1995年首个证实了PEI 可作为非病毒载体，至今，PEI已成为目前研究应用前景最广，转染效率最高的 阳离子聚合物之一【3】。PEI是含有最高阳离子电荷密度潜力的有机高分子。每 第三个原子均为氨基氮，其可被质子化，酸催化的聚合丙啶产生了一个非常复杂 的网络，这可以用来诱捕DNA，并且，由于有许多近邻的氨基，这使其在任何pH 值下都具有非常强的缓冲能力。PEI的细胞毒性很低，并且这种细胞毒性仅在远 高于最佳转染浓度时才出现【4】。目前认为，通过雾化吸入方式经PEI介导的基 因局部传递对肺部疾病的基因治疗具有广泛的应用前景【5】。Densmore CL等【6】 将PEI/P53、抗癌基因以气溶胶雾化方式治疗肺部肿瘤的动物模型。PEI介导的β 2肾上腺能受体(β2AR)基因体内转染对小鼠模型急性肺损伤具有治疗意义【7】 因此本课题利用PEI介导的目的基因进行体内转染，希望能改善缓解肺动脉高压 的病理进程。 血管内皮生长因子（Vascular endothelial growth factor ，VEGF）是一 种有丝分裂原，能特异性作用于内皮细胞并发挥多方面的作用，包括增加血管通 透性，诱导血管形成、血管生成、侧枝循环开放，促进内皮细胞生长，促进细胞 迁移和抑制细胞凋亡等。VEGF家族成员和他们的受体，在血管生成过程中起关键 作用，VEGF可与血管内皮上VEGFR2结合，通过多条信号通路作用引起血管生成、 血管形成，调节内皮细胞的增殖迁移和形态发生【8】。目前认为，VEGF基因转 移所产生的内源性VEGF,通过改善内皮功能而发生拮抗PH作用。 一氧化氮（NO）是一种活性自由基，具有神经递质、抗炎、抗肿瘤活性，同 时NO是一种内皮来源的舒张因子，是维持肺循环稳定的重要活性因子。可直接作 用于肺血管平滑肌使其舒张，并且可抑制肺血管平滑肌增殖和迁移，抑制血小板 在血管表面聚集等【9】。内皮型一氧化氮合成酶(Endothelial nitric oxide synthase，eNOS) 能促进内皮细胞合成NO，从而调节血管扩张；NO的合成受内皮 细胞中eNOS的表达及其活性调节，慢性缺氧不仅能引起内源性NO合成、释放减少， 而并也能影响其生物活性，使其生物活性降低，由此可进一步导致PAH的形成 【10】。目前，NO已被是美国F D A批准为治疗新生儿低氧性P H的药物，而N O 3 贵阳医学院 2014 届硕士研究生论文 吸入虽然有效，但由于直接给予NO 因半衰期短、易产生耐受性、副作用明显等 使其在临床应用受到限制。因此, 通过eNOS转基因技术恢复NO 的生成, 对血管 损伤性疾病的治疗具有重要意义 【11】。 关于VEGF 和 eNOS 的关系，研究表明eNOS 是VEGF 诱导血管新生的下游因子， VEGF 通过作用于 VEGFR-2，由PI3K/Akt 通路激活 eNOS，产生NO 【12】，引起 血管舒张，有效改善血管重构，改善外周循环阻力。 目前已有报道分别采用VEGF 及 eNOS 单