染色体涂染技术.ppt

染色体涂染技术Chromosome painting techniques 染色体涂染技术 染色体涂染技术即将整条染色体、某条染 色体臂（长臂或短臂）或者染色体某个片断的 DNA制备成探针，然后用荧光原位杂交的方法， 将探针杂交到中期分裂相染色体上，在荧光显微 镜下观察荧光素在染色体上标记的颜色，从而分 析和研究染色体的重组、畸变以及同源基因等的 一种新技术。 染色体涂染技术 1.染色体DNA探针的制备； 2.荧光原位杂交。 1.染色体DNA探针的制备 ①流式细胞分类法； ②克隆基因库或体细胞杂交株； ③染色体显微切割和PCR扩增等途径。 1.染色体DNA探针的制备 ①流式细胞分类法（flow cytometry） 该法是用一种或多种荧光染料将悬浮液中 的中期分裂相染色体染色。由于染色体大小、 形态、组成和结构的不同，所染色的特征有其 特异性，从而可以通过流式细胞术将特定的染 色体收集起来。 1.染色体DNA探针的制备 ①流式细胞分类法（flow cytometry） 局限性：如果受试物的染色体形态单一、数 目较多，如牛 (2n=60) 和狗(2n=78)的所有常染 色体及绵羊(2n=54)和马(2n= 64)的大部分常染 色体都是端位着丝点，因此，仅根据染色体的形 态和大小很难将所有的染色体准确地区分开来。 1.染色体DNA探针的制备 ②克隆基因库或体细胞杂交株 通过特定的克隆基因文库或者特异性的体细胞 杂交细胞系制备某条染色体整个或部分DNA探针。 该法特异性强，准确性高，并且可以与功能遗传 学的研究结合起来，但对实验室要求较高，取材 来源和研究范围有所限制 。 1.染色体DNA探针的制备 ③染色体显微切割和PCR扩增 显微切割 (microdissection)技术是在显微 状态或显微镜直视下直接或通过显微操作系统对 欲选取的材料进行切割分离并收集用于后续研究 的技术。 染色体显微切割分手工切割和激光切割法， 倒置显微镜上装配切割臂，安上硅化玻璃针，找 到分散良好的分裂相来切割所需染色体片段。 1.染色体DNA探针的制备 ③染色体显微切割和PCR扩增 早在上世纪70年代，染色体显微切割已应用于多线染 色体的研究，是细胞生物学常用的实验方法之一。当时由 于无法直接扩增染色体DNA，所以必须在显微镜下反复 切割若干拷贝的染色体，才能满足实验的要求这不仅费力 耗时，而且要求实验操作人员必须具备熟练的染色体分带 和鉴定经验，才保证实验的准确性。直到l989年Ludecke 等将PCR扩增与染色体显微切割结合起来，从而改进了这 种实验方法。对于同一条染色体，只要切割和收集5 ～10 个拷贝，通过PCR扩增，即可满足实验要求。从而极大地 提高了实验技术的可行性和准确性。 1.染色体DNA探针的制备 ③通过染色体显微切割和PCR扩增制备 特异性的染色体DNA探针。相对而言，该方 法具有直接、准确、 简便和应用范围广等优 点。 2.荧光原位杂交 fluorescent in situ hybridazation,FISH 什么是原位杂交？ 原位杂交是基于DNA分子复制原理而发展起 来的一种技术。用带有标记（放射性同位素、荧 光染料等）的DNA或RNA片段作为核酸探针,与 组织切片或细胞内待测核酸 (RNA或DNA）片段 进行杂交，然后用放射自显影等方法予以显示， 在光镜或电镜下观察目的mRNA或DNA的存在及 定位。 2.荧光原位杂交 荧光原位杂交是在20世纪80年代末在放射性原 为杂交技术的基础上发展起来的一种非放射性分子 细胞遗传技术，以荧光标记取代同位素标记而形成 的一种新的原位杂交方法。探针首先与某种介导分 子结合，杂交后再通过免疫细胞化学过程连接上荧 光染料。 2.荧光原位杂交 基本原理： 如果被检测的染色体或DNA纤维切片上的靶DNA与所 用的核酸探针是同源互补的，二者经变性-退火-复性，即可 形成靶DNA与核酸探针的杂交体。将核酸探针的某一种核 苷酸标记上报告分子如生物素、地高辛，可利用该报告分 子与荧光素标记的特异亲和素之间的免疫化学反应，经荧 光检测体系在镜下对待测DNA进行定性、定量或相对定位 分析。 2.荧光原位杂交 实验流程： FISH样本的制备→探针的制备→探针 标记→杂交→（染色体显带）→荧光显微 镜检测→结果分析。 2.荧光原位杂交 优点: 荧光试剂和探针经济、安全； 探针