孵育时间在二氧化钛选择性富集磷酸化肽中的影响.pdf

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１２，３２（３）：５９６２ 孵育时间在二氧化钛选择性富集磷酸化肽中的影响 詹　胜　银兴峰　李　慧　李　楠　阳小燕　孙雪松 （暨南大学生命与健康工程研究院　广州　５１０６３２） 摘要　目的：旨在探索孵育时间在二氧化钛选择性富集磷酸化肽中的影响。方法：以大肠杆菌 ＢＬ２１（ＤＥ３）为材料，预实验确定二氧化钛磁珠与肽段之间的最适比例，之后在此比例下继续探究 不同孵育时间条件下的富集效果，以观察孵育时间在二氧化钛富集体系中的影响。结果：预实验 确定磁珠与肽段之间最适比例为３∶１，在此比例下发现随着孵育时间的增加其富集效率会逐渐降 低，最后确定大肠杆菌中最适孵育时间为５ｍｉｎ。结论：孵育时间在大肠杆菌二氧化钛富集体系中 对富集效果有明显的影响，并且呈负相关。推测不同样品的最佳孵育时间与样品种属有关。 关键词　二氧化钛　磷酸化　孵育时间　大肠杆菌 中图分类号　Ｑ８１ 　　磷酸化是蛋白质翻译后修饰的重要共价修饰形 与阳离子结合。磷酸盐、羧酸盐及硫酸盐等都与二氧 式，普遍存在于真核与原核生物之中，是生物界最普遍 化钛具有良好的亲和力，其中磷酸盐亲和力最高。通 的一种蛋白质翻译后修饰，约有 １／３的蛋白质被认为 过添加有机酸２，５二羟基苯甲酸（２，５ＤＨＢ）和邻苯二 是具有磷酸化修饰现象的。而蛋白质的磷酸化与去磷 ［５］ 甲酸（ＰＡ） 可以有效降低非磷酸肽的结合，但由于其 酸化这一可逆过程更是几乎调节着包括细胞增殖、发 ［６］ 会造成电喷雾离子源的污染，故目前多采用Ｗｕ等 报 育、分化、骨架系统调控、新陈代谢、衰老与凋亡等几乎 道的以谷氨酸作为非特异性吸附抑制剂，这样既避免 ［１］ 所有的生命活动过程 。相对于真核生物，原核生物 ［７］ 了污染同时也可得到很好的富集效果。Ｚｅｎｇ等 发现 的磷酸化蛋白较少。例如，细菌中主要有三种磷酸化 肽段与二氧化钛珠子的比例对磷酸化富集结果有重要 系统，即组成重要信号传导途径 的双组分系统 影响，且比例与物种有关。本文针对路易斯酸碱反应 ［２］ （Ｃｐｘ） 、磷酸烯醇丙酮酸 －糖磷酸转移酶系统 的另一个影响因素———反应时间，在预先优化得出肽 ［３］ （ＰＴＳ） ，以及曾经被认为只存在于真核生物中的丝氨 段与珠子合适比例的基础之上，继续改变孵育反应的 酸、苏氨酸、酪氨酸的磷酸化系统［４］。 时间，通过观察和比较，发现孵育时间也是影响富集效 　　由于经过磷酸化修饰的蛋白质含量很少、磷酸化 率的重要因素，大肠杆菌的肽段与珠子孵育的时间并不 蛋白丰度低、质谱检测离子化效率低，复杂生物样品中 像目前报道真核生物常用的２０ｍｉｎ或者６０ｍｉｎ那样，而 大量高丰度非磷酸化肽段等原因造成直接检测的低检 是较短的５ｍｉｎ较为合适，表明孵育时间与物种有关。 出率，因此样品送检之前进行磷酸化肽段的富集显得 尤为重要。目前应用最广泛的是金属氧化物二氧化钛 １　材料与方法 富集法，具有富集效果好、价格低、操作方便等优点。