合成 sirna の导入方法 - タカラバイオ.pdfVIP

siRNAを哺乳動物培養細胞に導入する方法 任意の遺伝子に対してsiRNAによる遺伝子ノックダウンの効果を観察するには、siRNA導入用試薬 を用いて哺乳動物培養細胞に合成siRNAを直接導入するのが最も手軽な方法である。トランスフェ クション時に用いる試薬としては、タカラバイオからTransIT-TKO と RiboJuice Transfection Reagentの二種類の試薬が発売されており、どちらも導入効率が高く、操作も簡便で あるため、すぐに siRNAの効果を確認することができる。さらに、それぞれの試薬に対して、関連 遺伝子を強制発現する場合やレポータープラスミドを同時に導入する場合のコトランスフェクショ ン系の導入試薬とプロコールも充実しているので、コトランスフェクション系の実験も非常に簡単 にかつ正確に行うことができる。（siRNAの合成受託サービスについては「二本鎖RNAを用いたRNAi： ご注文方法」を参照。） 準備するもの ・ 哺乳動物培養細胞と細胞培養関連器具 ・培地 ・ マルチウェルプレート ・ 無血清培地 ・RNase free緩衝液 ［100 mM NaCl, 50 mMTris-Cl ( pH 7.5 )］に溶解した2本鎖siRNA ・Trans IT-TKO（Mirus社製） または RiboJuicesiRNATransfection Reagent (Novagen社 製) 実験手順 ：詳細な手順はプロトコール参照 ●TransIT-TKO の場合 2 (1)あらかじめ前日 （トランスフェクションの18時間程度前）に細胞 （1.9cmあたり50,000 細胞以下）をプレートに播種し、通常の血清入り完全培地でインキュベートしておく。 (2)無血清培地に TransIT-TKO を添加してよく混和する。( Mixture ) (3)室温で５～２０分間インキュベートする。 (4)１μＭに希釈した siRNをMixturA に添加eしてよく混和する。 (5)室温で５～２０分間インキュベートする。 (6)siRNAを含むMixtureを細胞に添加する。 (7)2 ４～７２時間後に細胞を回収して効果を確認する。 ●RiboJuicesiRNATransfectioReagentのn場合 2 (1)あらかじめ前日 （トランスフェクションの18時間程度前）に細胞 （1cmあたり10,000～ 40,000細胞）をプレートに播種し、通常の血清入り完全培地でインキュベートしておく。 (2)無血清培地に RiboJuicesiRNATransfection Reagentを添加してよく混和する。( Mixture ) (3)室温で５分間インキュベートする。 (4)１μＭに希釈した siRNAをMixtureに添加してよく混和する。 (5)室温で５～１５分間インキュベートする。 (6)siRNAを含むMixtureを細胞に添加する。 (7)２４～７２時間後に細胞を回収して効果を確認する。 タカラバイオRNAi BOOK 合成siRNAの導入方法 Page 1 of 7 0312.V1.0 実験例 ：siRNA導入効率の定量的な測定 ここでは、単純に両導入試薬のsiRNA導入効率の高さを示すために、FITC標識した合成 siRNA を用いた導入効率の評価試験を紹介する。FITC標識した合成 siRNAをそれぞれの試薬のプロ トコールに沿ってHEK-293細胞 ・HeLa細胞に導入した。２４時間後にフローサイトメトリーを 用いて標識 siRNAが導入された細胞数から導入効率を測定した。なお比較対照として、他社試 薬の導入効率も併せて測定した。 図1 各導入試薬を用いた場合の導入効率 図1に示すように