基于生物质谱的乙酸酐稳定同位素标记定量蛋白质组学方法的建立与优化.pdfVIP

第35卷 分析化学(FENXI HUAXUE) 研究报告 第l2期 2007年 l2月 Chinese Journal of Analytical Chemistry l687～l695 ：“‘‘‘…’‘…’‘…‘‘…‘‘…’‘…’‘…’： ：研究报告： ：…．．…．．…．．…．．…．．…．．…．．…．： 基于生物质谱的乙酸酐稳定同位素标记 定量蛋白质组学方法的建立与优化 刘新 应万涛 周春喜 蔡 耘 钱小红 (北京放射与辐射医学研究所，北京100850) (北京蛋白质组研究中心，北京102206) (蛋白质组学国家重点实验室，北京102206) 摘 要 建立了一种基于生物质谱的乙酸酐稳定同位素标记，定量蛋白质组学研究方法，优化了影响标记效 率的各种条件。在pH 8．0的N％B 0，／H B0 缓冲体系中，当乙酸酐摩尔浓度25倍过量于肽段摩尔量，22~C 反应30 min时，标记即可完全。对多对H ／D 一乙酸酐标记肽段在基质辅助激光解吸电离质谱中的动态范围 及定量准确度进行了考察，并通过串联质谱分析确定了乙酰化位点。结果表明：在l0倍和30倍动态范围内， 线性关系良好(r=0．99，r=0．98)，理论值和观测值的偏差分别为0．5％和20％。 关键词 乙酸酐稳定同位素标记，定量蛋白质组学，生物质谱 1 引 言 定量蛋白质组学是对生物体在不同时间和空间或不同生理病理条件下，蛋白质表达量及其变化进 行定量描述的科学¨ J。定量蛋白质组学研究的常用方法主要有两种：一是基于双向凝胶电泳技术的 定量方法。通过染色强度的差异，对蛋白质进行定量分析。荧光双向差异凝胶电泳(fluorescence two dimensional differential gel electrophoresis，DIGE)作为近几年新发展的蛋白质组定量方法，相对于传统 的双向电泳在灵敏度、动态范围和胶间的重现性方面都有显著性的提高 。但是，由于双向电泳本身 的局限性，对于高疏水性、极酸极碱和大分子量蛋白质均不能很好地分离，一个染色点可能包含不止一 个蛋白，难以实现自动化，以及DIGE试剂的昂贵等缺点，限制了该方法在蛋白组学研究中的广泛应 用 J。二是基于稳定同位素标记和质谱联用的定量方法，由于突破了上述定量方法的众多瓶颈问题， 正日益成为定量蛋白质组学研究中重要的技术方法 J。由于不同的蛋白质或者肽段在质谱中的离子 化效率不同，所以，无法直接从质谱图上对其进行定量分析。将化学性质相同，但质量不同的稳定同位 素作为内标，对不同生理或病理状态下表达的蛋白质或肽段进行标记，标记后混合样本，相同的蛋白质 或者肽段因其质量差异在质谱图中出现一对特征性的同位素峰。由于它们具有相同的离子化能力，可 以通过比较质谱峰的强弱，分析蛋白质在不同状态下表达量的变化。目前，稳定同位索标记的定量方法 主要有体内代谢标记和体外化学标记。体内代谢标记是通过在富含 N．或 C．元素¨ ” 或者含有稳定 同位素标记的氨基酸【12,13]的培养基中培养细胞完成的。但是，使用同位素富集的培养基可能会影响细 胞的生长和蛋白质的合成，造成定量不准确。使用稳定同位索标记的氨基酸对蛋白质进行代谢标记，虽 然对于细胞的生长没有显著影响，但所需试剂费用很高。而体外化学标记是在蛋白提取后，对蛋白质或 其酶解产生的肽段中的某个基团进行化学标记。Aebersold等¨ 首先开发了稳定同位索标记亲和标签 技术(isotope—coded affinity tags，ICAT)，并已经商业化，得到广泛的应用。ICAT试剂由三部分构成，一是 亲和标签，用于选择性富集被ICAT试剂标记的肽段；二是连接子(含有8个氢或氘原子，称为轻或重试 2007 l-17收稿；2007J07．15接受 本文系国家自然科学基金(NoNoNo、北京市科技计划重大项目(No．H030230280190)、国家重点基 础研究发展规划项目(No．2004CB518707)、国家自然科学基金重点项目(No和国家科技计划课题(No．2006CBOD1600) 资助