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松毛虫DNA的提取及ISSR反应体系的建立.pdf
农业生物技术学报 Journal ofAgricultural Biotechnology 2007，15 (6)：1068～1069
· 研究简报·
松毛虫DNA的提取及ISSR反应体系的建立木
高立杰 ，侯建华 。高宝嘉-一，安 哲2
(1河北农业大学林学院，保定071000；2河北唐山职业技术学院，唐山064002)
关键词：松毛虫；ISSR；反应体系
中图分类号：S188文献标识码：A文章编号：1006—1304(2007)一06—1068—02
Genomic DNA Extraction Methods and Optimization of lSSR
Reaction Systems for Pine Caterpillars
GAO Li—Jie ，HOU Jian-Hua ，GAO Bao—Jia ，AN Zhe
(1．CollegeofForestry AgricultureUniversityofHebei,Baoding071000,China：2．TangshanProfessionalTechnical
CollegeofHebei,Tangshan 064002，China．)
K哆神 ：pine caterpillars；ISSR；analysis system
ISSR技术是一种较好的分子标记技术，它具有重复性
2 结果和分析
高、结果可靠、操作简单等优点 (Zietkiewicz et a1．，1994；
Sanchez et a1．，1996)。松毛虫是针叶树种的重要害虫，目前尚 2．1 Mg 浓度和dNTP浓度对ISSR反应的影响
未见到利用ISSR标记技术研究松毛虫遗传多样性的报道， 图1表明，M 浓度在2．5mmol／L时扩增条带最多，多态
而高质量的总DNA及稳定的PCR反应体系是获取可靠Is． 性好，而且此浓度与购买的Mg2 浓度一致，无需稀释。因此确
SR标记结果的前提。本实验获得了提取高质量松毛虫基因 定最佳Mg 浓度为2．5 mmo]／L；图2中dNTP的浓度以0．20
组DNA的方法并优化了松毛虫ISSR．PCR反应体系。 mmol／L时扩增带最清晰、稳定，而且条带整齐、多态性好。
2．2 Taq DNA聚合酶浓度与引物浓度对ISSR反应的影响
1材料和方法
图3表明，5个浓度均有扩增产物，但Taq DNA聚合酶
1．1材料 在1．25 U时谱带较亮且清晰，扩增效果最好。故确定Taq
2006年7～8月采集松毛虫(Dendrolimus)蛹，羽化后取 DNA聚合酶适宜用量为1．25 U；图4显示，引物浓度为1．0
雌成虫作为实验材料提取DNA。 i．tmol／L，扩增效果最好，谱带清楚。
1．2 方法 ： 2．3 DNA模板浓度与退火温度对ISSR反应的影响
1．2．1 DNA提取 各松毛虫地理种群的DNA均采用SDS一 图5中显示不同浓度DNA模板对其扩增产物影响很
蛋白酶K法，主要改进之处是裂解缓冲液中的NaCI浓度增 小，但随量的增大产生非特异性带，本研究加入模板DNA以
至1．0 mol／L，1％琼脂糖凝胶电泳检测。 15-30 ng为宜：对l4条ISSR引物(表
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