活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3分子的构建及其致卵巢上皮性癌细胞凋亡的实验研究.pdfVIP

· 846· !生 箜 2鲞第12期 Chin J Obstet Gynecol，December 2007．V01．42．N0．12 ． 基础研究 ． 活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3分子的 构建及其致卵巢上皮性癌细胞 凋亡的实验研究 宋悦 沈铿 【摘要】 目的 构建能自我激活的活性半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)3分子，并探讨其对 卵巢上皮性癌(卵巢癌)细胞的致凋亡作用。方法 利用基因重组技术构建活性caspase_3分子—— rev—caspase-3及其重组腺病毒——Ad—rev—casp3；应用免疫组化方法、细胞计数试剂盒8、流式细胞仪 和蛋白印迹法分别检测rev—caspase-3作用后卵巢癌细胞系AO细胞中活性caspae-3蛋白的表达情况、 细胞存活率、凋亡率、细胞周期、caspase-3活性亚单位p17和聚(腺苷二磷酸一核糖)多聚酶(PARP)的 分解产物p85的表达水平，应用透射电镜观察rev—caspase-3作用后细胞的超微结构，实时PCR技术检 测细胞中凋亡相关基因的表达情况；建立卵巢癌裸鼠皮下及腹腔移植瘤模型，观测rev—caspase-3作用 后裸鼠生存情况及肿瘤体积的变化。结果 Ad—rev—casp3作用后的AO细胞中显著表达活性caspase一 3蛋白，细胞质明显棕染；细胞中活性caspase-3亚单位p17和PARP裂解片段p85的表达水平升高。 Ad—rev—casp3以感染复数(MOI)为70作用后的AO细胞存活率为30．3％，凋亡率为40．2％。Ad—rev— casp3以MOI=10作用后的细胞凋亡率只为3．4％，但此时S期细胞比例高达56．5％，G，期比例下降 至9．8％，与未感染Ad—rev—casp3(MOI=0)的AO细胞的S期和G 期比例显著不同(P均0．05)。 Ad—rev—casp3作用后的AO细胞呈现显著的凋亡形态改变，电镜下见明显的凋亡小体形成；细胞中活 性caspase-3基因的表达水平显著升高，为9．44。Ad—rev—casp3能显著延长荷瘤裸鼠的生存期，平均生 存时间为(213±16)d，并显著抑制移植瘤的生长，在第1次注射后53 d时抑瘤率为70％。结论 表 达rev—caspase-3的重组腺病毒载体对卵巢癌细胞有强烈的致凋亡作用，并可显著延长荷瘤裸鼠的生 存期，抑制肿瘤生长。 【关键词】 卵巢肿瘤；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶；细胞凋亡 Construction of autocatalytic c嬲pase-3 and its effects of inducing apoptosis in human ovarian carcmoma SONG Yue，SHEN Department of Obstetrics and Gynecology，Peking Union Medical College Ho~ital，Peking Union Medical College，Chinese Academy of Medical Sciences，Beijing 100730， China Corre 。 ， author：SHEN Keng，Email：shenkeng@vow．sina．com 【Abstract】 objective To construct the autocatalytic caspase-3 and investigate its apoptosis— inducing effect in ovarian cancer in vitro and in vivo．Methods PCR recombination technique was used to construct autocatalytic caspase-3 which is named as rev—caspase-3，and Ad—Max system was used to prepare recomb inant adenovirus containing rev—caspase-3．which is named as Ad．rev．Casp3． Immunohistochemistry Was used to detect active caspase-3 expression。 Cell