shRNA—CXCR4对人乳腺癌细胞增殖活性的影响.pdfVIP

厉红元，等．shRNA-CXCR4对人乳腺癌细胞增殖活性的影响 不清楚。近年，趋化因子受体(CXC chemokine re TATGACAACAGCCTCAA G．I’I’CAAGACGC I’I’GAGGC ceptor4，CXCR4)及其配体基质细胞衍生因子 1 TGTIGTCATAC 唧 GAATFCA一3’，反义链3’一G (stromal cell-derived factor-1，SDF-1)相互作用形成 CATACTG ITGTCGGAG ITCAAG ITCTGCGAACTCCG 的反应轴SDF-1／CXCR4在乳腺癌生长，转移中的 ACAACAGTATGAAAAAACTIAAGTTCGA．5’，转录 作用越来越受到人们的关注…。利用分子生物学 的siRNA-GAPDH为 CUUGAGGCUGUUGUCAUAC 技术，阻断SDF-1／CXCR4反应轴，可能成为肿瘤治 UU。 疗的一个新靶点。本实验拟利用构建shRNA CX． 1．2．2．3 阴性对照HK 正义链5’一GATCCGACT． CR4质粒，从体外实验途径沉默CXCR4基因，探讨 TCATAAGGCGCATGCTICAAGACGGCATGCGCC ITI1A 对3株人乳腺癌细胞(MCF一7、MDA—MB一231、MDA． TGAAGTC T丌TGTCGACA-3’，反义链3’一GCTGA MB-435s)增殖活性的影响。 AGTA ITCCGCGTACGAAG ITCTGCCGTACGCGGAA TACTICAGAAAAAACAGCTGr兀1CGA一5’，转录的 1 材料和方法 siRNA．HK为GCAUGCGCCUUAUGAAGUCUU。 1．1 细胞株与试剂 人乳腺癌细胞株MDA MB 1．2．3 质粒转染及稳定 筛选阳离子脂质体介导 231、MDA—MB-435s由上海复旦大学附属肿瘤医院 的质粒转染按Lipofectamine转染试剂说明进行转 沈镇宙教授惠赠，MCF一7购于中科院上海生物细胞 染。转染后36 h传代细胞，第2天开始将转染的细 所；shRNA质粒载体pGenesil．1(简称pG)购于武汉 胞在G418的培养基中培养，含抗生素的培养基每 晶赛公司；Lipofectamine购于INVITROGEN，质粒提 周换液两次。第10～14天后，观察到抗性克隆，筛 取试剂盒购于AXYGEN，连接试剂盒总RNA提取试 选获取单克隆抗性细胞，培养增殖，以备后续实验。 剂、cDNA合成及PCR扩增试剂，B—actin购于TaKa- 1．2．4 RT—PCR测定细胞株CXCR4基因的表达 、 Ra；兔抗人多克隆抗体 CXCR4(fusin(H一1 18)：SC一 实验分为4组，①实验组：shRNA．CXCR4；②空白对 9046)购于SANTA CRAUZ公司。辣根过氧化物酶 照组：等体积的1640培养液；③阴性对照组：shRNA 标记羊抗兔多克隆抗体购于北京中杉金桥。 — HK；④阳性对照组：shRNA—GAPDH。细胞总RNA 1．2 方法 抽提及cDNA合成按试剂盒说明书进行。PCR扩 1．2．1 细胞培养 MCF一7、MDA-MB一231、MDA—MB一 增：PCR反应体系的反应体积为50 l：cDNA 10 Ixl， 435s 3株人乳腺癌细胞用含10％小牛血清、100 U／ 引物浓度50 nmoL／L，Taq酶1U。CXCR4基因PCR ml青霉素和100 U／ml卡那霉素的RPMI一1640培养 引物：正义链5’一GGTGGTCTATGTrGGCGTCT一3’，反 液，