基因工程 02 基因工程的工具酶.ppt

2）修复DNA/RNA杂合双链上DNA切口处的磷酸二酯键 5‘…G--C--U--C--U--G--C--A--G--G--A--G … 3’ 3‘…C--G--A--G A--C--G--T--C--C--T--C … 5’ P OH nick 3）连接多个平头双链DNA分子 Summary 基因工程中常用的酶？ 宿主控制的限制与修饰现象(Host-controlled restriction and modification)？ Klenow酶、Taq酶、碱性磷酸酶、多核苷酸激酶、末端脱氧核苷酸转移酶（TdT） 限制性核酸内切酶的分类、识别序列的特征、切割出的末端、作用机制、反应系统、常规反应条件？ 淡字诀 为人处世，交朋待友，对势利纷华，似乎不必太过于苛求，当以“淡”字当头。看淡些，看开些，人生也就豁然开朗，有滋有味了。正如“平平淡淡才是真” 1、君子之交淡如水 2、淡看人生，善待生命 3、淡泊明志，莫为名利遮望眼 4、减少心欲，满足心灵 基因工程中对核酸的“精雕细刻”主要用酶作为工具。分子生物学研究过程中发现的酶，许多都用作工具。 核酸内切酶和DNA连接酶的发现与应用，才真正使DNA分子的体外切割和连接成为可能。这两种酶是基因工程赖以创立的重要的酶学基础。 在1970年之前，没有哪一种方法可以定点切割DNA分子，所有对DNA进行切割的方法都是非序列特异性的。所能采用的方法也仅仅是机械切割而已。组成DNA双螺旋的这两条又长又细的DNA分子太过坚硬而无法在溶液当中很轻易地被打开。强烈的超声波能把DNA分子切割成300nt左右大小。高速搅拌也曾用于DNA分子的切割，但在1500rpm的转速下30min后，DNA分子变成了8kb左右的长度，而且断裂也时有发生。断裂所产生的末端通常都是短的单链DNA，这样的产物末端势必要连接起来。（教材P26） 在60年代，噬菌体关于宿主限制与修饰现象的生化背景已经被阐述得很清楚。这项研究的顶点就是大肠杆菌K12的限制性内切酶的纯化。它的纯化也暗示了对DNA进行可控制的操作的光明前景，因为这种酶能够将未经修饰的DNA切割成大片段，因此它肯定有特定识别的序列。但遗憾的是这种酶能够识别特定的序列，但切割的位置并不特定，甚至远离识别位点好几kb之远。 1970年突破终于伴随着一种来源于流感嗜血杆菌 （Haemophilus influenzae）的内切酶的发现而来临。这种酶的活性非常简单，它能识别特定的靶序列并且在特定的序列进行切割，使得DNA序列变成单独的特定大小的片段。（教材P26） 在60年代，噬菌体关于宿主限制与修饰现象的生化背景已经被阐述得很清楚。这项研究的顶点就是大肠杆菌K12的限制性内切酶的纯化。它的纯化也暗示了对DNA进行可控制的操作的光明前景，因为这种酶能够将未经修饰的DNA切割成大片段，因此它肯定有特定识别的序列。但遗憾的是这种酶能够识别特定的序列，但切割的位置并不特定，甚至远离识别位点好几kb之远。 1970年突破终于伴随着一种来源于流感嗜血杆菌 （Haemophilus influenzae）的内切酶的发现而来临。这种酶的活性非常简单，它能识别特定的靶序列并且在特定的序列进行切割，使得DNA序列变成单独的特定大小的片段。（教材P26） 识别序列呈典型的旋转对称型回文结构;大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧. 识别序列呈典型的旋转对称型回文结构;大部分酶的切割位点在识别序列内部或两侧. For example, phage λ DNA has five sites for EcoRI but the different sites are cleaved non-randomly (Thomas Davis 1975). For example, phage λ DNA has five sites for EcoRI but the different sites are cleaved non-randomly (Thomas Davis 1975). Epithet：绰号、称号。 核酸内切限制酶消化DNA底物的反应效率，在很大程度上是取决于所使用的DNA本身的纯度。污染在DNA制剂中的某些物质，例如蛋白质、酚、氯仿、酒精、乙二胺四乙酸(EDTA)、SDS(十二烷基硫酸钠)、以及高浓度的盐离子等，都有可能抑制核酸内切限制酶的活性。 核酸内切限制酶消化DNA底物的反应效率，在很大程度上是取决于所使用的DNA本身的纯度。污染在DNA制剂中的某些物质，例如蛋白质、酚、氯仿、酒精、乙二胺四乙酸(EDTA)、SDS(十二烷基硫酸钠)、以及高浓度的盐离子等，都有可能抑制核酸内切限制酶的活性。 任何一个提供商都会标明其产品的最佳作用条件 0.25μL Sources