基因工程技术概要1.ppt

基因工程技术 Jackson, Symons,and Berg (1972) – generated first recombinant DNA molecules Cohen and Boyer (1973) – produced first plasmid vector capable of being replicated within a bacterial host vectors – carriers of foreign DNA 定义： 基因工程（gene engineering） 重组DNA技术（recombinant DNA technique）：是指在各种酶的作用下，将细胞外的核酸片断（目的基因）在体外与病毒、细菌或其它载体通过入工剪切、连接构成重组DNA分子，将其导入受体细胞并使之无性繁殖（称之为“克隆”）和 表达，这种有目的的应用分子克隆技术,人为的改造基因,改变生物的遗传性状的系列过程,总称为基因工程 应用： 克隆感兴趣基因进行序列分析，研究其组织结构。 转入原核表达载体，进行大规模蛋白质合成,生产多肽产品。 转入真核表达载体，导入细胞，研究其功能，表达调控机制等 基因工程基本步骤： 基因工程流程示意图 构建重组分子（连接） 原料： 目的基因片段来源： 基因组DNA PCR 方法扩增特定的目的基因片段（已知基因序列，已有其它表达或克隆构建或从商品化的cDNA文库扩增） 通过RT-PCR 方法得到目的基因cDNA 人工合成基因片段（价钱昂贵） 目的基因来源选择： 取决于解决什么问题？ 基因功能研究 PCR： 引入合适的酶切位点，一个/两个。 加保护碱基，1-3个。 加上想要的标签，如 Flag, Myc, His, HA。 启始及终止密码子。 片断的回收与纯化 载体： 载体(Vector)是目的基因的运载工具，其作用是将目的基因带入受体细胞中，并使目的基因扩增和表达。 种类： 克隆载体(cloning vector) 用于在受体细胞中进行目的基因扩增的载体。一般具有较低的分子量、较高的拷贝数和松弛型复制子。主要由细菌质粒或与其它质粒、噬菌体及真核生物病毒的DNA重组构建（PBR322）。 表达载体(expression vector) 使目的基因在宿主细胞中得以表达的载体。可将重组体DNA导入适合的受体细胞，使所载荷的目的基因能够复制、转录和翻译（pCDNA3）。 穿梭载体(shuttIe vector) 能在两种不同的生物体内复制和往来穿梭的载体. 其可同时具有细菌质粒的复制原点和真核生物可识别的 复制原点或酵母菌的自主复制序列（ARS），它即能在 原核细胞中扩增又能在真核细胞中复制和表达。主要用 于原核细胞与真核细胞之间进行基因转移。 质粒载体 具有复制起始点，这是质粒自我增殖的必要条件。 具有较小的分子量，较高的拷贝数，是一个松弛型的质粒。 具有某种选择性标记以区别转化和非转化细胞。大多是一些抗菌素抗性基因，赋予受体细胞对某些抗生素的抗性，为转化子选择提供便利。（Ampr；Tetr） 具有若干限制性内切酶单一识别位点，便于外源基因插入。 克隆载体: PBR322  特点： 分子量小，4.3kb，便于操作。 有两个抗性基因，便于转化子筛选。 有几个常用的限制性内切酶的单一位点，分布在抗性基因上，7种位于四环素选择标记上，4种位于Amp抗性基因上。外源基因的插入将破坏抗性基因的完整性，导致抗性基因插入失活，这种特性可用于区分重组和非重组分子。 松弛性质粒，在大肠杆菌细胞内有较高的拷贝数，当细菌蛋白质合成停止时，它仍能继续复制。 TA 克隆 TOPO-TA 表达载体：带有调控基因表达所必需的转录与翻译元件，如启 动子等，这些调控元件应与宿主细胞相适应。 原核 His-tag: pQE系列(Qiagen), pET22(Novagen) GST-tag: pGEX系列(Pharmacia) 真核表达载体：大多是穿梭载体。 pFLAG-CMV系列(Sigma) Tet-On/Tet-Off Expression Systems DNA分子的体外连接：方法 粘性末端：相同的粘性末端互相配对进行连接 两种情况： （a）目的基因和载体用同一种限制酶切割后连接。载体 易自身环化。 用碱性磷酸酶(能除掉DNA-5`端P基团，使5`端带一