HBV感染培养人胎肝细胞后差异应答基因的初步分离.docVIP

　　HBV感染培养人胎肝细胞后差异应答基因的初步分离 【摘要】 目的：建立培养人胎肝细胞感染HBV后差异应答基因的消减文库，并从中克隆鉴定出新的应答基因. 方法：分别从HBV感染及未感染的胎肝细胞中提取总RNA，用SMART PCR技术合成全长双链cDNA，经RsaⅠ酶切后将感染细胞的cDNA分为两组，分别衔接两个不同的接头，再与未感染细胞的cDNA进行两轮抑制性杂交及两轮抑制性PCR，将产物与T/A载体连接构建成消减cDNA文库，并转染大肠杆菌进行文库扩增，挑取克隆进行筛选排除假阳性，再行序列分析，鉴定胎肝细胞感染HBV后的差异应答基因. 结果：成功构建高效消减的HBV感染胎肝细胞cDNA文库，得到158个白色的克隆，随机选择了128个克隆经PCR扩增获得含有明确单一目的片断的克隆99个，长约100～400 bp，经筛选后得到70个克隆，测序表明有16个差异表达的基因，其中可能的新基因有5个. 结论：用抑制性消减杂交技术成功建立了HBV感染培养人胎肝细胞的消减cDNA文库，为进一步大规模筛选HBV感染后的应答基因奠定了基础，初步筛选出的新基因片断为进一步研究宫内感染的分子机制提供了依据. 【关键词】 HBV 胎肝细胞 杂交 消减文库 克隆 0引言 慢性乙型肝炎易形成长期免疫耐受和复杂疾病谱，从HBsAg携带、慢性乙型肝炎到肝硬化、肝癌等，宿主对病毒的反应在发病机制中起重要作用. HBV与宿主相互作用不仅仅发生在细胞表面，很可能是一个非常复杂的相互作用网络，HBV与宿主组织细胞之间这种特定的相互作用决定着病毒的存活与疾病的发生、发展及转归，而这种相互作用反映在基因水平上则表现为病毒感染后宿主细胞基因表达谱的改变. 完整的HBV感染肝细胞基因表达谱的研究有可能使我们更深入地认识HBV的分子致病机制，从而发现更多、更有效的抗病毒作用靶标. 本研究我们用抑制性消减杂交技术克隆并鉴定HBV感染胎肝细胞后的应答基因，为阐明HBV宫内感染的分子机制奠定基础. 1材料和方法 1.1材料DMEM培养基购自Gibco公司， 胎牛血清购自Highclone公司，总RNA提取试剂盒购自Promega公司，SMART PCR cDNA合成试剂盒、 PCRSelect cDNA消减杂交试剂盒、Advantage2 cDNA PCR试剂盒、PCRSelect Differential Screening试剂盒、NucleoTrap PCR纯化试剂盒及尼龙膜、单面乳胶胶片均购自Clontech公司，［α32P］ dATP购自北京福瑞生物工程公司核酸研究室. 1.2方法 1.2.1HBV感染培养人胎肝细胞［1-2］用纤维连接素包被培养皿，将冻存的22 g/L. 以感染细胞为检测方，以未感染细胞为驱动方，加T4 DNA连接酶1 μL（6.66 μkat），分别与接头1和2连接，16 h反应过夜后进行接头连接效率检测. 在鉴定连接效率满意 （gt;25%）后，将连接有接头1和2的检测方ds cDNA 1.5 μL分别与1.5 μL驱动方ds cDNA在68℃下杂交8 h后，立即将经过第一次消减杂交的两组体系混合，另加新变性的驱动方cDNA 1 μL，68℃杂交12 h，稀释（1∶200）. 取1 μL稀释后的第二次杂交后产物做模板，在50×advantage Taq聚合酶作用下，以接头1和2的外侧序列分别为5′及3′引物，进行第1次PCR扩增；取第一次PCR产物3 μL，10倍稀释后取1 μL做模板，以接头1和2内侧序列分别为5′及3′的巢式PCR引物，进行第二次PCR扩增，并进行PCR产物消减效率检测. 1.2.3cDNA消减文库的构建及PCR鉴定克隆取3 μL PCR产物及2 μL线性化质粒载体，在1 μL T4 DNA连接酶的作用下，14℃反应12 h后，-20℃保存. 取2 μL连接反应产物转染200 μL感受态大肠杆菌，225 r/min摇菌1.5 h，取200 μL菌液种植于含氨苄青霉素的LB/Xgal/IPTG培养板上，37℃培育18 h. 计数培养板中直径gt;1 mm清晰的白色及蓝色菌落数. 随机挑取128个白色菌落于含氨苄青霉素的LB培养基中37℃摇菌过夜，取菌液1 μL做模板，以接头1和2内侧序列分别为5′及3′的PCR引物，进行PCR扩增，选取含有明确单一目的片断的克隆99个进行杂交筛选. 1.2.4斑点杂交法进行差异筛选取鉴定过的含有单一明确目的片断克隆的PCR反应液5 μL加5 μL 0.6 mol/L NaOH， 混匀变性； 取2 μL新鲜变性cDNA，分别点样于尼龙膜上；0.5 mol/L TrisCl（pH 7.6）中和，杂交炉中70℃烤膜2 h固定. 预杂交1 h后加入32P标记的4种