单细胞凝胶电泳技术检测小鼠成纤维细胞DNA的氧化.docVIP

　　单细胞凝胶电泳技术检测小鼠成纤维细胞DNA的氧化 【关键词】 单细胞凝胶电泳；DNA单链断裂；DNA氧化损伤；DNA修复 　　摘要：目的 观察小鼠成纤维细胞由过氧化氢(H2O2)引起的DNA损伤及其修复，并详细介绍单细胞凝胶电泳技术。方法 培养NIH3T3细胞，H2O2造成细胞氧化损伤，单细胞凝胶电泳技术(SCGE，et Assay)检测细胞DNA的损伤情况。结果 ①建立了H2O2致NIH3T3细胞DNA损伤的分级图谱；②H2O2引起的小鼠成纤维细胞DNA单链断裂与H2O2的浓度呈依赖性关系；③细胞在除去H2O2后15min已出现明显修复，多数修复可在1h内完成，但少数修复可能需要较长时间才能完成。结论 单细胞凝胶电泳技术是一种简便、敏感的检测DNA氧化损伤的方法。 　　关键词：单细胞凝胶电泳；DNA单链断裂；DNA氧化损伤；DNA修复 　　Oxidantinduced DNA damage and the reparation　in NIH3T3 mouse fibroblasts by single cell gel electrophoresis 　　ABSTRACT: Objective To study H2O2induced single strand breaks(SSB) formation in DNA and the reparation in NIH3T3 mouse fibroblasts by single cell gel electrophoresis technique (SCGE, et Assay) and to introduce SCGE. Methods The NIH3T3 mouse fibroblasts age ined by SCGE. Results ① H2O2induced damage class graph of the DNA et in the NIH3T3 mouse fibroblasts aged DNA edependent and could be achieved 15min after incubation. The data indicated that most reparations ight take longer time. Conclusion Single cell gel electrophoresis technique is a simple and sensitive method to determine oxidationinduced single strand breaks(SSB) formation in DNA. 　　KEY EM和小牛血清(FBS)购自Sigma公司；细胞培养平皿为Coring公司产品；et Assay试剂盒购自Trevigen公司。 　　1.2 细胞培养及H2O2损伤方法 DMEM培养液中加入10%(体积分数)小牛血清(FBS)、青霉素和链霉素各100u/mL。 NIH小鼠成纤维细胞(NIH3T3)用该培养液调整至3.3×104个细胞/mL的细胞悬液，将细胞接种于直径35mm的培养皿(3mL/皿)，于37℃、5%(体积分数)CO2的细胞培养箱中培养24h。置换成不含小牛血清的DMEM，在培养皿中加入H2O2使终浓度分别为0.3-0.5mmol/L，培养15min。再次置换成新鲜的含10%(体积分数)小牛血清的DMEM，分别于H2O2处理后即刻、15、30、60、120min收集细胞进行单细胞凝胶电泳分析。 　　1.3 单细胞凝胶电泳(et Assay) 本方法的原理是先将细胞固定在葡聚糖凝胶中，用碱(0.3mol/L NaOH)将DNA变性，然后使DNA裂解所形成的片段在电场中迁移，没有受损伤的DNA，因分子较大迁移较慢保留在原来核的位置，而受损伤的DNA则被裂解成较小的片段而发生明显的迁移，DNA被荧光染色后在荧光显微镜下观察，可见裂解的DNA片段形成象彗星一样的长尾，根据“彗尾”的形状、亮度、尾长评价DNA的损伤。收集的细胞与10g/L低熔点葡聚糖凝胶(保温在40℃，pH 10，PBS溶解)混合。将此细胞悬液铺敷于预先已铺设了一层1g/L葡聚糖凝胶的玻片上，玻片在4℃放置10min后，被置于溶胞液中[2.5mol/L NaCl、100mmol/L EDTA、10mmol/L Tris、1%(体积分数)TritonX100，pH= 10]4℃，60min。然后水平地置于裂解液中(0.3mol/L NaOH、1mmol/L EDTA，pHgt;13)4℃，20-40min，TBE缓冲液洗两次，每次5min。于TBE缓冲液中电泳10min(1V/cm)，乙醇脱水，自然干燥，滴加SYBR Gr