向内皮细胞分化的骨髓间充质干细胞体外三维构建组织.docVIP

　　向内皮细胞分化的骨髓间充质干细胞体外三维构建组织 【摘要】 目的 以绵羊骨髓间充质干细胞在体外向内皮细胞诱导分化(MSCECs)作为种子细胞，去细胞猪主动脉瓣为支架，体外三维构建组织工程心脏瓣膜(TEHV)。 方法 羊骨髓穿刺液，以Percoll梯度分离液离心法获取骨髓间充质干细胞(MSCs)，在内皮细胞诱导分化液中体外培养、扩增，鉴定；以酶消化法制备去细胞猪主动脉瓣叶支架，将体外培养扩增的诱导分化后的MSCs种植于支架上，体外三维培养，构建组织工程心脏瓣膜，研究细胞功能及组织学结构。 结果 MSCECs为梭形的成纤维细胞状形态,呈网格状排列；αSMA、Vimentin、CD31及Ⅷ因子细胞免疫染色阳性，培养上清液NO及ET1分别为（165.6±8.9）μmol/L及（50.6±5.6）ng/L，其中NO值明显高于未诱导组（Plt;0.05）,猪去细胞瓣膜支架去细胞完全，弹力纤维及胶原纤维保持完整；诱导分化的MSCs在支架上生长良好，形成完整的细胞层。 结论 MSCs在体外向内皮细胞诱导分化后已初步具有内皮细胞功能,在去细胞猪主动脉瓣膜支架上生长良好,可以在体外初步构建TEHV。 【关键词】 内皮细胞； 骨髓细胞； 间充质干细胞； 生物假体； 心脏瓣膜，人工； 组织工程； 绵羊 心脏瓣膜置换手术已经成为终末期心脏瓣膜疾病的主要治疗手段，但目前临床上广泛应用的机械瓣及生物瓣膜远未达到理想程度，而组织工程心脏瓣膜（tissue engineering heart valve,TEHV）为人工瓣膜的研制提供了一种新的思路，正成为瓣膜外科领域的研究热点。目前国内外研究主要集中于种子细胞及支架选择上，其中以正常动脉内皮细胞及骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）研究为著，但动脉内皮细胞创伤大，需牺牲功能血管为代价，而MSCs取材方便，但内皮细胞功能不足，构建的TEHV整体功能尚有欠缺；虽然国内外大量研究均以人工材料为支架，但材料科学目前现状尚不能提供一种满意的符合TEHV要求的支架[13]。本研究以绵羊骨髓间充质干细胞体外向内皮细胞诱导分化后（bone mesenchymal stem cells induced to differentiate to endothelial cells，MSCECs)作为种子细胞，去细胞猪主动脉瓣膜为支架，体外三维构建TEHV,为TEHV的进一步动物体内实验研究奠定基础。 1 材料和方法 1.1 材料 DMEM培养基，胎牛血清，0.05% Trypsin0.02% EDTA (美国Gibco公司), Olympus倒置相差显微镜(IX70型，日本Olympus公司),Ⅷ因子抗体,αSMA抗体,CD31抗体(美国Sigma公司),Vimentin抗体(美国Neomarker公司),一氧化氮(NO)药盒(晶美生物工程北京有限公司),内皮素(ET1)放射免疫药盒(解放军总医院科技开发中心放射免疫所),纤维连接蛋白(Fibronectin,Fn),内皮细胞生长因子（ECGF），血管内皮生长因子（VEGF）及碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）(美国Sigma公司)。 1.2 MSCs的分离 无菌下在绵羊髂前上棘处行骨髓穿刺，抽出10 mL左右骨髓，以DMEM液稀释1～2倍后，1 500 r/min离心10 min，弃含有脂肪及血小板的上清，再以等量的DMEM液重悬血细胞,沿管壁缓慢加入含10 mL密度为1.073 g/mL的Percoll梯度离心液的离心管内,用水平离心机以2 000 r/min离心30 min，吸取上中层之间的乳白色单个细胞层移入另一离心管中，并以gt;5倍的DMEM液稀释混匀后，2 000 r/min离心10 min，弃上清，加入少量的DMEM液制成细胞悬液，获取MSCs悬液。 1.3 MSCECs培养及体外扩增 将上述获取的MSCs悬液以2×105 cm-2底面积接种于培养瓶中,加入内皮细胞诱导分化培养液(含10%胎牛血清的DMEM液，VEGF 10 ng/mL，ECGF 10 ng/mL，bFGF 10 ng/mL，肝素50 IU/mL),置于体积分数为0.05、37 ℃的CO2饱和湿度恒温孵箱中培养，48 h后换液，以后每3天换液1次，当细胞达到80%～90%融合时以0.05% Trypsin+0.02% EDTA消化传代，取第2代细胞进行鉴定，第4代以后用于研究构建TEHV。 1.4 MSCECs的表型鉴定及细胞功能测定 将第2代MSCECs以每孔2×105接种于预置盖玻片的6孔板中，加入培养液1 mL，24 h后取出盖玻片,PBS液冲洗，甲醇固定20 min，常规免疫组化方法，加入αSMA抗体、Vi