含KSHV vIL6基因原核表达载体的构建及融.docVIP

　　含KSHV vIL6基因原核表达载体的构建及融 【摘要】 　　目的： 在大肠埃希菌中表达卡波济肉瘤相关疱疹病毒（Kaposi′s saraassociated herpesvirus，KSHV）vIL6基因，并进一步纯化和鉴定表达蛋白。方法： 以本实验室已构建的重组质粒pGEX6p1vIL6为模板，PCR扩增目的基因片段，将PCR产物克隆至原核表达载体pET32a(+)中，构建vIL6的重组原核表达质粒pET32a(+)vIL6。将重组质粒转化大肠埃希菌（E.coli）BL21（DE3）感受态细胞，用异丙基硫代βD半乳糖苷（IPTG）诱导表达融合蛋白。表达产物通过镍亲和层析柱纯化并经蛋白质印迹法鉴定。结果： 限制性内切酶检测和基因测序证实，成功构建了含有vIL6基因的原核表达载体。蛋白质印迹法结果显示，在大肠埃希菌BL21(DE3)中HisTag融合蛋白得到了表达，亲和层析法纯化后获得了相对分子质量为43 000的vIL6融合蛋白。结论: 重组质粒pET32a(+) vIL6能在大肠埃希菌BL21(DE3)中表达，利用镍亲和层析柱可纯化获得融合蛋白。 【关键词】 病毒白细胞介素6基因； 原核表达； 融合蛋白； 卡波济肉瘤相关疱疹病毒 　　［Abstract］Objective: To construct the prokaryotic expression vector carrying KSHV vIL6 gene and purify the fusion protein in E.coli.Methods： The DNA fragment of the vIL6 gene from pGEX6p1vIL6 ed pET32a(+) vIL6. Then the rebinant vector ed into E.coli BL21(DE3). The expression of the histidinetagged(HisTag) fusion protein mobilized Ni2+ absorption chromatographic column, respectively. Results: The prokaryotic expression vector carrying vIL6 gene olecular atographic column. Conclusion: Rebinant vIL6 can be expressed in E.coli BL 21(DE3) and the fusion protein can be obtained. 　　［Key an herpesvirus 8，HHV8），1994年由美国哥伦比亚大学病理学家Chang等［1］采用代表性差异分析法（representational different analysis）首先在卡波济肉瘤组织中发现。KSHV感染与三种疾病密切相关：卡波济肉瘤、原发性渗出性淋巴瘤（primary effusion lymphomas）和多中心卡斯特莱曼病（multicentric Castleman′s disease），而KSHV基因组编码的病毒白细胞介素6（viral interleukin6, vIL6）在其中发挥着重要的作用［2］。KSHV的生命周期分为潜伏感染期和裂解复制期［3］。vIL6是由KSHV裂解复制期基因K2编码的多功能细胞因子。我们先前将vIL6克隆在pGEX6p1载体中，考虑到用pGEX6p1表达的蛋白融合了一个GST，GST蛋白较大，作为免疫原制备vIL6抗体时会增加无关的表位，为此，本研究选用pET32a(+)载体，在重组载体多克隆位点的上游有一编码6个组氨酸的HisTag序列，可与它下游的表达片段形成融合蛋白，但HisTag序列并不影响表达产物的生物学活性，因而不必通过酶水解来获得目的蛋白，使整个表达过程更为简便，同时该序列又可作为蛋白标签用于目的蛋白的检测和纯化。本文通过PCR扩增出可编码204个氨基酸的vIL6基因片段，构建pET32a(+)vIL6原核表达载体，诱导表达融合蛋白，为进一步制备vIL6单克隆抗体提供免疫原并为研究vIL6生物学功能提供重组蛋白奠定基础。 　　1 材料和方法 　　1.1 主要试剂、仪器 　　质粒pGEX6p1vIL6，pET32a（+）及宿主菌E.coli BL21（DE3）均为本室保存［4］。限制性内切酶BamHⅠ，Hind Ⅲ和T4 DNA连接酶均购自晶美生物公司。小剂量琼脂糖凝胶回收试剂盒为Omega公司的产品。pET系统融合蛋白His