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蛋白质的纯化 报告人： 纯化策略 确定研究目标：要获得什么样的蛋白质？ 理化性质 生物活性 重点注意问题 保证活性 减少不必要的纯化步骤 合理组织纯化步骤 蛋白质的分离纯化方法 沉淀法 根据分子大小不同：超滤法、透析法（膜分离法）、 凝胶过滤法（GF）、超速离心法等。 根据分子所带电荷差异：离子交换层析法(IEX)、电泳法、等电聚焦等。 根据疏水性不同：疏水层析(HIC)、反相色谱(RPC) 亲和层析(AC) 沉淀法 原理：是使蛋白质胶体颗粒的表面水化膜或表面电荷破坏，从而使蛋白质沉淀。 盐析法 有机溶剂沉淀法 等点电沉淀法 选择性变性沉淀法 聚合物沉淀法 在生物大分子制备中最常用的几种沉淀方法是： 中性盐沉淀（盐析法）：最大的特点是环境温和，不易造成蛋白质变性。因此适用于各种蛋白质和酶的分离纯化。缺点是分辨率底，且后续处理时需要除盐。 有机溶剂沉淀：分辨率高于盐析法，但容易引起目的蛋白失活。所以多用于生物小分子的分离纯化比如多肽、寡肽。 等电点沉淀：其局限是，须事先了解蛋白的PI；且沉淀过程中可能发生变性和失活，部分蛋白等电点沉淀后不容易溶解，因此较少用于目的蛋白的沉淀。用于氨基酸、蛋白质及其他两性物质的沉淀，但此法单独应用较少，多与其他方法结合使用。 选择性沉淀（热变性沉淀和酸碱变性沉淀）：多用于除去某些不耐热的和在一定pH值下易变性的杂蛋白。三氯乙酸是比较常用的酸变性剂，尤其在分析样品的浓缩而不需考虑活性的条件下用得多。 有机聚合物沉淀：是发展较快的一种新方法， 主要使用PEG聚乙二醇作为沉淀剂，常用PEG6000和20000。它条件温和，不易变性，且沉淀效果强，很少量的PEG可沉淀大量的蛋白。缺点是PEG除去比较困难。 有机溶剂沉淀 原理 F= ，有机试剂有较低的介电常数e； 水合作用，破坏水化膜。 操作注意事项 冰浴 缓加 温和搅拌 色谱技术 色谱联用策略 不同色谱技术由于原理不同适用于不同的起始条件； 应尽可能将不同的色谱技术联合起来，以减少中间环节： 理想的情况是：前一柱洗脱液条件等同于后一柱的起始条件。 起始条件 色谱技术 结束条件 小样品体积 样品被稀释 缓冲溶液被交换 低离子强度 PH改变或高离子强度 高离子强度 低离子强度 特定的结合条件 特定的洗脱条件 色谱联用流程 IEX HIC GF AC GF RPC IEX HIC GF AC GF (NH4)2SO4 HIC IEX GF HIC GF IEX GF GF （脱盐） AC GF 各种色谱介绍 凝胶过滤层析 也称大小排阻层析，是一种根据分子的大小和形状来进行分离的方法。不同的蛋白质分子通过凝胶微孔时因迁移能力不同而被分离。 利用有一定孔径范围的多孔凝胶作为固定相，（在其分离范围内）按分子大小将样品中各组份分离开来。大分子先被洗脱，小分子后被洗脱。 应用 脱盐 Sephadex G10、25 缓冲溶液交换 中间纯化 Sephadex G200 精纯 Sephacryl 、Superdex 常用填料 Sephadex系：是以氯代环氧丙烷进行交联的葡聚糖珠状凝胶。 经典的凝胶介质 Sepharose系:经过纯化的琼脂糖，含极少的带电集团。 型号最多、应用最广 Sephacryl系：有是丙基葡聚糖与N,N’-亚甲基双丙稀酰胺共聚而成。 经济高效 Superdex系：是葡聚糖与琼脂糖共聚而成的复合凝胶。 最新，选择性强，分辨率极高 建议流速20~39cm/h 建议流速30~60cm/h 层析条件的选择 凝胶介质：分离范围、分辨率。微粒越小，柱效越高，峰形越狭窄，分离度越高。 流速：孔径较小较结实的填料，耐受的流速要高于孔径大的填料。 上样：上样量；样品浓度70mg/ml。 各种色谱介绍 离子交换层析 原理：首先是根据蛋白质的带电类型（阳离子或阴离子），然后根据其相对