植物基因工程中的λ噬菌体载体.pptVIP

载体（vector）是把一个有用的目的DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中去进行繁殖和表达的工具。植物基因工程技术中尤为重要的是载体，不同目的基因需要采用不同的载体。组成植物基因工程载体系统常见的几种载体有：　　质粒　　λ噬菌体　　柯斯质粒(cosmid)　　m13单链噬菌体。 噬菌体是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的细菌病毒，结构简单、基因数少，是分子生物学与基因工程的良好实验系统。 噬菌体有严格的宿主特异性，只寄居在易感宿主菌体内。 噬菌体具有高效率的感染性和自主复制繁殖性能，使它能高效导入受体细胞，并能使携带的外源基因在受体细胞中高效扩增，所以噬菌体被开发成基因工程的有用载体。 噬菌体分类 目前用于基因克隆的噬菌体载体及其衍生载体有：单链M13噬菌体载体；λ噬菌体载体；P1噬菌体载体；噬菌粒载体；等等。其中使用最多的是入噬菌体。 λ噬菌体是温和噬菌体，属长尾噬菌体科，头壳为直径约50nm的二十面体，其内包裹一长线状双链DNA分子（46500bp）。 基因组长约50kb ，至少包括61个基因，除少数例外，大多数编码基因均是按功能的相似性成簇排列。左右臂包含λDNA复制、噬菌体结构蛋白合成、组装成熟噬菌体、溶菌生长所需全部序列；对溶菌生长来说，中段是非必需的。 如果将左右臂和中段都去除，仅留下λDNA而端包装噬菌体所必需的cos序列，再加上质粒的复制序列、标志基因、多克隆位点等，就可构成cos质粒或称为粘粒的载体。粘粒可插入45kb长的外源DNA，然后用λ噬菌体外壳蛋白包装成噬菌体，感染大肠杆菌后，粘粒的DNA能以质粒的形式在细菌中繁殖而被克隆。所以粘粒主要用于DNA文库的构建。 当噬菌体感染宿主细胞后, 双链DNA 分子通过cos 而成环状。在感染早期, 环状DNA 分子进行转录。在此期间, 噬菌体有两条复制途径可供选择: 一是裂解生长。环状DNA 分子在宿主细胞里复制若干次, 合成了大量的噬菌体基因产物, 形成子代噬菌体颗粒, 成熟后使细菌裂解, 释放出许多新的有感染能力的病毒颗粒。另一是溶源性生长。噬菌体DNA 整合进宿主菌的基因组,然后像细菌染色体上的基因一样进行复制, 并传递给下一代细菌。由于噬菌体头部包装容量的限制，重组λ-DNA分子大小只能在39—52kb之间。 λ噬菌体的繁殖方式 λ噬菌体载体的构建 构建方式： 1、插入型。只具有一个限制酶位点，可便于外源DNA插入，这种载体叫插入型载体（insertion vectors）。 2、置换型。含有二个限制酶切点，在两个位点之间的DNA区段可以被外源DNA片段所取代。这种载体叫置换型载体（replacement vectors）。 至今已用噬菌体开发出许多插入型和置换型载体插入型载体:?ZAP,ZAP,?gt10,gt11等置换型载体:?GEM-11,?GEM-12,EMBL3,EMBL4等 构建过程 野生型λ噬菌体DNA必须经过改造才能成为理想的载体，其构建过程主要有：①删除基因组中非必需区，建立外源DNA片段的替换点，增加承载外源DNA片段的容量。②在非必需区内插入或替换选择的标记基因和目的基因。③建立重组λDNA分子的体外包装系统，使之有效地感染受体细胞。简而言之，将目的基因插入或替换进入病毒基因组的可替代区，再利用病毒的侵染性，将目的基因导入受体细胞，这就是病毒作为“分子运输车”的基本机理。? λ噬菌体载体的应用 一、建立cDNA文库 　噬菌体载体系统是在eDNA文库构建中最早使用的载体系统，其主要优点是插入片段的装载容量大，适合于全长的eDNA克隆，不仅质量高、代表性好，而且重组噬菌体颗粒的感染活性在4℃环境中极其稳定，非常适合于eDNA文库的长期保存。 　cDNA与载体重组，或经体外包装成噬菌体颗粒后转导宿主细胞，或不经体外包装直接转染宿主细胞，但转导的效率较高。 λDNA作为外源基因的克隆载体λ基因组中间部分占30% 的DNA(包括重组和溶源化基因)并不是噬菌体裂解生长所必需的，裂解生长所需的基因都在基因组的左侧和右侧，而典型的λ克隆载体在部分或全部非必需基因的两侧含有限制酶位点，这就赋予了λ载体克隆大片段的能力，外源基因插入到限制酶位点之间，在体外包装成噬菌体，虽然包装效率仅达10%，但一经包装，在大肠杆菌中形成噬菌斑的效率可达100% 。目前由λ衍生的许多载体被广泛地应用于基因克隆中，尤其是在构建基因文库中的应用产生了非常好的效果。 二、克隆外源目的序列为了使外源基因能有效转录，将其插入λDNA的PL启动子或PR启动子的有效转录区内。 λ噬菌体载体的克隆原理和步骤 （1）通过裂解过程增殖载体 通过噬菌体的增殖，从中提取噬菌体DNA 噬菌体载体均含有与裂解生长所必须的基因片断