生后小鼠肾脏发育过程中Ⅳ型胶原表达的实验研究.docVIP

　　生后小鼠肾脏发育过程中Ⅳ型胶原表达的实验研究 【摘要】 　　目的 观察Ⅳ型胶原在生后小鼠肾脏发育过程中的表达规律，探讨Ⅳ型胶原在小鼠肾发育成熟过程中的作用。方法 采用免疫组织化学方法检测生后不同日龄小鼠肾组织中Ⅳ型胶原的表达，用细胞图像分析技术和体视学方法对结果进行分析。结果 Ⅳ型胶原表达于生后各日龄小鼠肾脏肾小体、肾小管和集合管的基膜，且随着肾脏的发育成熟，Ⅳ型胶原表达量逐渐增加。结论 在生后肾发育成熟过程中，Ⅳ型胶原表达于基膜存在的部位，可能对基膜的发育成熟起一定的作用。 【关键词】 Ⅳ型胶原 小鼠 肾脏 发育 　　Abstract: Objective To observe the expression of Collagen Ⅳ in the developing kidney of neonatal mouse and study its function in renal development. Methods The expression of Collagen Ⅳ in neonatal（N）mouse kidneys ined by IHC, analyzed in a cell image analytical system and stereological method. Results The expression of Collagen Ⅳ can be seen in the basement membrane of glomeruli, renal tubules and collecting ducts. By cell image analytical system and stereological method, the expression of Collagen Ⅳ ainly seen in the basement membrane during renal development. It may play an important role in the development of basement membrane. 　　Key ouse; kidney; development 　　1 引言 　　Ⅳ型胶原与层粘连蛋白、纤维粘连蛋白、硫酸乙酰肝素和其它大分子交联成网格状结构，共同构成基膜［1］。Ⅳ型胶原是构成基膜的主要蛋白，占基膜干重50％，穿透整个基膜［2］。它通过受体integrin（整合素）和非integrin类的介导，与细胞之间发生粘附反应，直接或间接的控制细胞活动，如粘附或转移，分化和极化，增殖或凋亡及基因表达等，在基膜的形成和稳定中起非常重要的作用［3］。国内外学者对Ⅳ型胶原在肾组织中表达的研究显示，在肾脏发生发育过程中Ⅳ型胶原以一种复杂的动态方式表达于基膜［4］。本实验应用免疫组织化学方法、细胞图像分析技术和体视学方法对生后小鼠肾发育过程中Ⅳ型胶原的表达及其含量变化进行了系统观察和定量分析，为进一步探讨Ⅳ型胶原在肾脏发育成熟过程中的规律及作用提供基本的实验依据。 　　2 实验材料和方法 　　2.1 实验动物 　　昆明小鼠，体重25～30 g， 雌雄各半，供交配用，由辽宁医学院实验动物中心提供。 　　2.2 主要试剂 　　Ⅳ型胶原多克隆抗体（SANTA公司提供）。 　　SABC试剂盒（北京中杉金桥生物有限公司提供）。 　　DAB显色试剂盒（北京中杉金桥生物有限公司提供）。 　　2.3 实验方法 　　2.3.1 动物的培育 　　选用成年健康昆明小鼠，按雌雄比例1∶1同窝饲养，采用检查阴道栓脱落的方法确定雌鼠受孕时间。以观察到阴道栓脱落的最早时间计为胚0天。记录受孕时间，然后将孕鼠分笼饲养，每日早8时、晚5时观察生产情况，以观察到仔鼠出生的最早时间计为生后0天。记录出生日期与母鼠同窝饲养。选取生后1天、3天、7天、14天、28天、40天的仔鼠，每组4 只。 　　2.3.2 标本制备 　　将生后各龄仔鼠经乙醚麻醉后，于腹后壁取出左肾，用排刀法沿横轴将肾脏切开，入10％中性福尔马林固定3 h，流水冲洗半小时，常规酒精脱水，二甲苯透明，石蜡定向包埋，对各组织块作厚为5 μm的连续切片，供免疫组织化学染色使用。 　　2.3.3 免疫组织化学染色 　　切片常规脱蜡至水，3％ H2O2消除内源性过氧化物酶活性，经pH 6.0的枸橼酸盐缓冲液抗原热修复，滴加正常山羊血清封闭液、一抗（1∶100）过夜后，滴加生物素标记的二抗37℃孵育30 min，滴加SABC37℃孵育30 min后DAB显色，苏木素复染核，常规脱水、透明、封片，光学显微镜下观察。上述各部均用PBS缓冲液冲洗。用PBS代替一抗作阴性对照。阳性表达为肾小体、肾小管和集合