生化技术第五章.ppt

DHFR+细胞 DHFR- 细胞 原核细胞表达载体的构建比较困难，但市场上已有不少构建好的表达载体可供选择，常用的有： 非融合型表达载体pKK223-3 pKK223-3具有1个强的tac(trp-lac)启动子。该启动子是由trp启动子的-35区域和lac UV-5 启动子的-10区域，操纵基因及SD序列组成。紧接tac启动子的是1个取自pUC8的多克隆位点，使之很容易把目的基因定位在启动子和SD序列后；在多克隆位点下游还包含1个很强的rrnB核糖体RNA的转录终止子，载体其余部分是由pBR322组成的。 在使用pKK233-3质粒时，要相应地使用LacI宿主，如JM105。一个具有PKK223-3质粒类似结构的载体被用于表达Lambda CI基因时，经IPTG诱导产生的蛋白，占可溶性细胞抽提液中总蛋白的18-26%。由此可见，在需要获得大量的基因产物时，pKK223-3确实是1种非常有用的工具。 原核生物对真核基因进行非融合表达，容易得到较大的表达量，但表达产物不易形成正确的折叠，不能被糖基化，容易被分解，或形成包含体，裂解包含体时，蛋白质会变性，需要复性，才能得到有活性的蛋白质。 分泌型克隆表达载体PINⅢ系统 PINⅢ是以pBR322为基础构建的。 用这个分泌型载体来表达金黄色葡萄球菌的核糖核酸酶A，分泌到细胞间质中产物达300mg/L，占细胞总蛋白量的9%。为了进一步提高载体的表达效率，把IPP启动子的-35区的DNA顺序AATACT改为TATACT，结果目的基因的表达产量提高到1500mg/L，占细胞总蛋白量的42%，其中有40%的基因产物是经过信号肽酶加工而成的成熟蛋白。 融合蛋白表达载体pGEX系统 pGEX系统载体的组成成分基本上与其它表达载体相似，含有启动子(tac)及Lac操纵基因、SD顺序、LacI阻遏蛋白基因等。这类载体与其它表达载体不同之处是SD顺序下游就是谷胱苷肽巯基转移酶基因，使克隆的外源基因与谷胱苷肽巯基转移酶基因相连。当进行基因表达时，表达产物为谷胱苷肽巯基转移酶和目的基因产物的融合体。 这个载体系统具有如下优点： 可诱导高效表达； 表达的融合蛋白质纯化方便； 使用凝血酶和Xa因子就可从表达的融合蛋白中切下所需要的蛋白质和多肽； 用EcoRI从λgt11载体中分离的基因可直接插入pGEX-1λT中 原核细胞提高表达水平的措施 提高翻译水平 调整SD序列与ATG之间的距离。SD顺序与ATG的距离不同，IL-2表达水平可相差2-2000倍。应根据不同的启动子，调整好SD序列与起始密码ATG的距离，对提高外源基因的表达水平非常重要。 用点突变的方法改变某些碱基。有资料表明，紧随起始密码下游的几组密码子不同，可使基因的表达效率相差15-20倍。另外，在不改变编码的氨基酸顺序的条件下，尽量用强密码子取代弱密码子，确有可能提高表达水平。 增加mRNA的稳定性。外源基因下游插入REP顺序或其它具有反转重复顺序的DNA片段可起到稳定mRNA，提高表达水平的作用。 减轻细胞的代谢负荷 外源基因在细菌中高效表达，必然影响宿主的生长和代谢，而细胞代谢的损伤，又必然影响外源基因的表达。合理地调节好宿主细胞的代谢负荷与外源基因高效表达的关系，是提高外源基因表达水平不可缺少的一个环节。 目前常用的方法有： 诱导复制。减轻宿主细胞代谢负荷的一个重要措施是当宿主菌生物量积累到一定水平后再诱导细胞中质粒DNA的复制。 诱导表达。将宿主菌的生长和外源基因的表达分开成为两个阶段，是减轻宿主细胞代谢负荷最常用的方法。一般采用温度诱导或药物诱导(如IPTG)。一般而言，化学诱导比温度诱导更为方便和有效，且将相应的阻遏蛋白基因直接克隆到表达载体上，比应用含阻遏蛋白基因的菌株更为有效。 提高表达蛋白的稳定性 在大肠杆菌中表达的外源蛋白往往易被细菌的蛋白酶降解，因而大大降低外源基因的表达水平。因此，提高表达蛋白的稳定性，防止细菌蛋白酶的降解是提高外源基因表达水平的有力措施。 表达融合蛋白。表达融合蛋白的优点和基本方法已如前述。 采用某种突变菌株保护表达蛋白。大肠杆菌蛋白酶的合成依赖于次黄嘌呤核苷(lon)，因此采用lon-缺陷型菌株作受体菌，则使大肠杆菌蛋白酶合成受阻，从而使表达蛋白得到保护。另外，可将将Pin基因克隆到质粒中并转化大肠杆菌，细菌的蛋白酶便受到抑制，外源基因的表达产物受到保护。 表达分泌蛋白。表达分泌蛋白是防止宿主菌对表达产物的降解，减轻宿主细胞代谢负荷及恢复表达产物天然构象的最有力措施。欲在大肠杆菌中表达分泌型外源蛋白，必须首先考虑目的蛋白被分泌的可能性。其次，要防止目的蛋白的某些序列被信号肽酶错误识别，以致把目的蛋白切成碎片进而部分或大部分失去生物活性。 包含体对表达的影响 以大肠杆菌为宿主菌高效表达外