酵母双杂交技术.pptVIP

黑龙江省重点学科检查汇报 哈尔滨医科大学 生物化学与分子生物学学科 人类基因组计划结束给科学工作者极大鼓舞，同时也引出了更多的问题： 大量涌现出的新基因，它们有什么功能？编码什么蛋白？在生命过程中发挥什么样的作用？ 这些问题靠传统的研究方法不可能解决。蛋白质组（proteome）和蛋白质组学（proteomics）的概念就是在这个基础上提出的。 1994年9月在意大利Marc Wilkins正式提出了蛋白质组（proteome）的概念。用于指代特定时间一个基因组或者一种组织产生并利用的所有蛋白质。 蛋白质组学研究内容 蛋白质鉴定： 双向电泳结果找出差异蛋白质电 对差异点蛋白质： 分子量及等电点分析 western blot或者免疫共沉淀等技术初步鉴定蛋白质种类 质谱技术分析蛋白质的氨基酸序列 在数据库中比对确定蛋白质的家族归属。 蛋白质的修饰： 真核生物蛋白质翻译后会进行修饰： 磷酸化 乙酰化 糖基化 这些修饰是调节蛋白质功能的重要方式 蛋白质功能确定： 研究蛋白质的功能，蛋白质相互作用 酵母杂交技术 噬菌体展示技术 RNA干扰技术 蛋白质功能研究： 噬菌体表面展示技术(phage surface display) 酵母杂交技术（yeast hybridization） RNA干扰技术 蛋白质鉴定 双向电泳技术 质谱分析技术 蛋白质相互作用的研究技术 蛋白质：结构蛋白 功能蛋白 生命基本过程是功能蛋白质在时空上有序和协调作用的结果 从研究单一蛋白质的结构与功能关系发展为研究蛋白质间的相互作用 一、蛋白质相互作用的种类 分子或亚基的聚合 四级结构蛋白质亚基间的互相聚合 聚合的亚基是固定不变的 聚合靠氢键、疏水作用力等次级键 分子杂交 同工酶亚基间的聚合 聚合的亚基是可变的 聚合靠次级键 分子识别 蛋白质之间普遍存在的专一性结合作用 抗体与抗原、酶与底物、配体与受体 结合局部构像相嵌互补，必要时局部构像发生变化 局部有相应的化学基团产生足够结合力 分子自我装配 在特定条件下生物大分子自动装配成具有生物活性的细胞器或病毒 蛋白质、核酸、糖装配成核糖体 多酶体 相关的酶彼此有机的结合在一起 丙酮酸脱氢酶：丙酮酸脱氢酶、二氢硫辛酸乙酰转移酶、二氢硫辛酸脱氢酶 二、蛋白质间作用力 氢键 主链氢键：二级结构 侧链氢键：三、四级结构 表面氢键: 蛋白质间作用 离子键 正电荷与负电荷间的静电引力 酸性氨基酸和碱性氨基酸多在球形蛋白质的表面，解离的带电基团互相吸引 和溶液的盐浓度有关 疏水作用力 在水介质中球形蛋白质形成立体结构时总是趋向于将疏水基团包埋在分子内部。 不是疏水集团之间有吸引力，是疏水基团出自避开水的需要被迫靠近。 在生理温度范围内随温度增高而增加 范德华氏力 极性分子或极性基团之间定向效应 极性物质和非极性物质之间诱导效应 非极性分子或基团之间的分散效应 单个力很小但数量很大 三、噬菌体表面显示技术-筛选结合结构域 技术建立的原理和条件： 1.抗原抗体反应 抗原抗体特异性反应通过抗原决定簇实现 抗原决定簇位于分子表面，5-7氨基酸组成 2.多肽在噬菌体表面有独立活性 3.多肽化学合成技术的日趋成熟 丝状噬菌体特点： 基因组是单链DNA,只能感染F＋细菌 复制形式是双链，可用于基因操作和转化 有5种结构蛋白： PⅢ通过与F菌毛结合感染细菌 PⅧ与噬菌体的成熟和稳定有关 PⅢ蛋白： PⅧ蛋白： 73个氨基酸 23个氨基酸的信号肽 1-5:可活动区，露出噬菌体表面，插入多肽 6-24:占据噬菌体表面 25-35:高度疏水区 36-50:与DN