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生物技术制药 第四章 动物细胞制药 第一节 概述 （1）发现细胞和创立细胞学说（1665年） （2）组织培养或细胞培养。1885年德国生理盐水培养鸡胚组织 （3）细胞工程时代： 基因工程的理论和技术， 细胞融合的理论和技术， 细胞核移植的理论和技术， 染色体改造的理论和技术， 转基因动、植物的理论和技术， 细胞大量培养以及产物分离纯化的理论和技术。 （4）细胞工程制药-现代制药技术中常用的手段。 第二节 动物细胞的形态和特点 一、动物细胞的形态 细胞的分化（或特化） 形态分化在离体培养同样也存在。 离体培养的细胞分为两类： 贴壁依赖型（anchorage-dependent）：贴壁细胞 非贴壁依赖型（anchorage-independent）：悬浮细胞。 一、动物细胞的形态 1、贴壁细胞 生长要求 供细胞贴附的支持物， 贴附因子(来源细胞自身或培养基)。 形态： 成纤维样细胞：来源于中胚层组织的细胞，生长时呈放射状、旋涡状或火焰状走行； 上皮样细胞：来源于外胚层和内胚层组织的细胞，生长时彼此紧密连接成单层细胞片。 一、动物细胞的形态 2、悬浮细胞 　细胞的生长不依赖支持物表面，可在培养液中呈悬浮状态生长。 3、兼性贴壁细胞 兼具上述两种生长方式的细胞，称为兼性贴壁细胞。如CHO细胞、小鼠L929细胞。 贴附在支持物表面上生长时呈上皮或成纤维细胞的形态，而当悬浮于培养基中生长时则呈圆形。 二、动物细胞的生理特点 1、细胞的分裂周期 　一般为12~48h，细胞分裂周期=间期（G1期+S期+G2期）+分裂期（M期） G1期：凡细胞无增殖活动时皆滞留在G1期 S 期：DNA的合成，一般为6~8小时 G2期：DNA量加倍，RNA合成和染色体螺旋化，持续时间短，一般为2~5h。 M期：一般持续时间很短，仅0.5~1h。相当于有丝分裂的中后期和末期，主要是染色体的变化、分裂，并形成子细胞。 二、动物细胞的生理特点 2、细胞生长需贴附于基质，有接触抑制现象 大多数正常二倍体（dipoid）细胞的生长都需要贴附在一定的基质，伸展后才能生长增殖。 接触抑制或密度依赖抑制：当细胞在基质上分裂增殖，逐渐汇合成片时，细胞与其周围细胞相互接触时，细胞停止增殖的现象。 一旦细胞转化为异倍体后，细胞可多层生长，细胞密度可大大增加。 二、动物细胞的生理特点 3、正常二倍体细胞的生长寿命是有限的 原代培养： 传代培养： 有限细胞系：即有限的生长传代时间的细胞系，取决于细胞来源的种族和年龄，人胚成纤维细胞约可培养50代，鸡胚的30代，小鼠的8代。 无限细胞系（连续细胞系）：当细胞突变为异倍体后，该细胞可无限继代 二、动物细胞的生理特点 4、动物细胞对周围环境比较敏感 无细胞壁保护，因而外界的物理化学因素很容易产生影响。 5、动物细胞培养基的要求高 必需氨基酸需要12种以上 维生素8种以上 多种无机盐和微量元素 主要碳原的葡萄糖 多种细胞生长因子和贴附因子 二、动物细胞的生理特点 6、动物细胞蛋白的合成途径和修饰功能与细菌不同 游离的核糖体：合成蛋白质都在细胞质的基质内 粗面内质网上的核糖体：合成的蛋白质是分泌性的和膜中的整合蛋白，多数为糖蛋白。 糖链加工：蛋白质上的糖链有的在内质网上加接，有的在高尔基体中加接。其中内质网中加接的是N-链寡糖，在高尔基体内加接的是O-链寡糖。 第三节 生产用动物细胞的要求和获得 一、生产用动物细胞的要求 原代正常组织分离的细胞 二倍体细胞 传代细胞 按照FDA对细胞株的要求，控制最终产品中DNA残留量。 二、生产动物细胞的获得 原代细胞：是直接取自动物组织、器官，经过粉碎、消化而获得的。 二倍体细胞系：原代细胞经过传代、筛选、克隆，从而从多种细胞成分的组织中挑选并纯化出某种具有一定特征的细胞株。 转化细胞系：失去了正常细胞的特点，可以无限增殖。 三、常用生产用动物细胞的特性 （1）WI-38： 　女性高加索人正常胚肺组织的二倍体细胞系，核型2n=46。曾被广泛用于制备疫苗。 （2）MRC-5： 　 1966年来源于14周正常男性，特性和用途与WI-38相似，对多种人的病毒敏感，用于疫苗的生产。 三、常用生产用动物细胞的特性 （3）CHO-K1： 中国地鼠卵巢中分离的一株上皮样细胞。在培养时需加入脯氨酸。核型为2n=20~22。 CHO-dhfr-：一株缺乏二氢叶酸还原酶的营养缺陷突变株，培养时需次黄嘌呤和胸苷。 三、常用生产用动物细胞的特性 （4）BHK-21： 来源：地鼠幼鼠的肾脏，经过单细胞克隆。 特性：成纤维细胞，2n=44。 用途： （1）多用于增殖病毒，生产多瘤病毒、口蹄疫病毒和狂犬病毒疫苗 （2）构建工程细胞。 三、常用生产用动物细胞的特性 （5）Vero： 来源：正常的成年非洲绿猴肾； 特性：贴壁依赖性成纤维细胞