22 pelota ctd的表达纯化.docVIP

doi:10.6043/j.issn.0438-0479.201604036 人Pelota C端结构域张兰君，林丹，林天伟* 摘要：Pelota在进化上是非常保守的RNA结合蛋白。人源Pelota mRNA所有的组织一个多功能的蛋白参与多种生物途径。本研究人源Pelota C端大肠杆菌表达采用亲和层析、凝胶柱层析的方法，获得纯度大于97%的人源蛋白。动态光散射实验蛋白较高均一性结晶优化的Pelota C端结构域蛋白晶体2.6 埃米分辨率。蛋白晶体的空间群为P6522，胞常数为a=7.882，b=7.882 ，c=19.746 nm。本研究人源Pelota C为进一步研究Pelota的及其与下游蛋白奠定了基础。 关键词：Pelota C端结构域；人源；表达；纯化；结晶 中图分类号Q 356.1 文献标志码A Pelota蛋白在进化上保守的多功能蛋白古细菌、拟南芥、酵母、线虫、人和小鼠中pelota相似度较高的同源基因[1-7]人源和鼠源的pelota基因，分别位于染色体5q11和染色体13上面在人类和小鼠的胚胎发育很多组织中表达；在果蝇中Pelota蛋白的转录同样贯穿果蝇的整个发育阶段。Pelota在细胞周期有丝分裂及减数分裂[1, 3]、生殖干细胞的自我更新[4, 8-11]、mRNA的监控中[12-18]以及空核糖体回收再利用中[19]都有很重要的作用。 Pelota蛋白长度在374到395个氨基酸之间，高等生物的Pelota蛋白相对较长。所有物种的Pelota蛋白都是由三个结构域组成：含有核定位信号的N端结构域、中间结构域和C端酸性结构域。Pelota蛋白的中间结构域和与真核肽链释放因子1eukaryotic release factor 1，eRF1）的中间结构域和结构相似；N端结构域与eF1的氨基端结构域不同，却与Sm-fold蛋白相似[20-22]。根据目前的Pfam分类方法[23]，Pelota蛋白属于eRF1家族的亚家族。 收稿日期：2016-04-18 录用日期：2016-06-28 基金项目：高等学校学科创新引智计划 （“111”计划）(B06016)*通信作者：twlin@xmu.edu.cnPelota与其他蛋白的相互作用位点主要是Pelota在中， Pelota C大肠杆菌表达纯化0.26 nm分辨率Pelota CTD蛋白晶体三明治，中心夹层是四个β折叠：β1、β4、和β2反向平行，β3和β2平行，α1-5包围其中的β折叠中心。Pelota CTD蛋白晶体结构eRF1 CTD的结构eRF1 CTD的minidomain和羧基端末尾的一个α螺旋。eRF1 minidomain与识别终止密码子minidomain和其它序列表明Pelota蛋白不参与mRNA的正常翻译过程。其功能主要是参与mRNA的质量控制。Pelota CTD与同源的酵母Dom34蛋白相比，它们之间的参与与其它蛋白相互作用的作用面很相像，说明两个结构域在功能上的作用也比较类似。这些结果为更有进一步的Pelota功能研究奠定了结构基础。 1材料和方法 1.1 材料 Pelota CTD基因来自厦门大学生命科学学院韩家淮教授实验室；大肠杆菌表达载体pET-22b、大肠杆菌DH5α为Novagen公司产品Superdex-75 16/60 Column来自GE healthcare life sciences；结晶所用试剂来自Sigma和Fluka公司，其余均为国产分析纯试剂。 主要仪器AKATA快速蛋白液相系统ImageQuant 300凝胶成像系统GE healthcare life sciences；Nano-ZS动态光散射仪Malvern公司；Oryx8蛋白质自动结晶Douglas Instruments；24孔晶体培养板来自XtalQuest公司；MicroMax-007HF X-ray衍射仪光源部分来自Rigaku；Mar345 dtb X-ray衍射仪探测器来自Mar Research。 1.2 pET22b-Pelota CTD表达载体的构建 编码Pelota CTD（氨基酸265385位）用PCR引物（正义链引物：5’-AGG AGA TAT ACA TAT GCG CCT TTC AGA CAC TAA AGC TGC TGG G-3’；反义链引物：5’-GGT GGT GGT GCT CGA GAT CCT CTT CAG AAC TGG AAT CAC CCT CTT-3’）扩增并回收。Pelota CTD和pET22bNde I和Xho I双酶切，（ExoⅢ）通过Ligation Independent Cloning（LIC）连接转化DH5α感受态细胞质粒测序验证无误用于。 BL21(DE3)为Pelot