大肠杆菌的m13单链噬菌体dna m13 dna载体的构建.ppt

第九章 基因工程载体及其选用 第一节 质 粒 一、质粒的一般特性 (一) 质粒的分布、大小、数目 质粒广泛地分布于原核生物细胞中，也存在于某些真核细胞（酵母的2μ环状质粒）。 质粒DNA分子量范围为1—200×106Da。 一个细胞内的质粒数量变化也很大，有1至几个的，也有几十个的，甚至有数百个。这取决于质粒的复制类型。如果质粒的复制是严紧型的，每个细胞只有1个至几个质拉；如果质粒的复制是松弛型的，每个细胞中质粒有10-200拷贝数。 (二)质粒DNA的构型 三种不同的构型： 当其两条核苷酸链均保持着完整的环形结构时，称之为共价闭合环形DNA(cccDNA)，这样的DNA通常呈现超螺旋的SC构型； 如果两条多核苷酸链中只有一条保持着完整的环形结构，另一条链出现有一至数个缺口时，称之为开环DNA(ocDNA)。 若质粒DNA的双链均发生断裂而形成线形分子，则通称为L构型。 (三)质粒DNA的理化性质 质数DNA具有一般核酸分子的理化特性。 能溶于水，不溶于乙醇等有机溶剂， 在一定pH下可解离而带电荷 能吸收紫外线，可嵌入某些染料，如溴化乙锭。 比较能抗切割和抗变性。 (四)质粒DNA的生物学特性 (1)寄生性：质粒只能在宿主的细胞内复制。 (2)稳定性：每种质粒在宿主细胞中保持着一定的拷贝数。 (3)同源性：不同质粒之间可能存在一定的同源区。 (4)重组性：两种不同的质粒处于同一宿主细胞中或者一种质粒处于一种宿主细胞中，有可能发生质粒与质粒之间或质粒与染色体之间的重组。 (5)不相容性：有相同复制始区的不同质粒不能共存于同一宿主细胞中。该不相容性的分子基础主要是由于它们在复制功能之间的相互干扰造成的。 (四)质粒DNA的生物学特性 (6)传递性：有些质粒在细菌间能够传递，具有传递性的质粒带有一套与传递有关的基因。 (7)消除性：存在于宿主细胞中的质粒，可用某些办法将其去除。 (8)复制类型：严紧型质粒的复制受到宿主细胞蛋白质合成的严格控制，松弛型质粒的复制不受宿主细胞蛋白质合成的严格控制。 (9)表现型：不同的质粒有不同的表型。如对抗生素的抗性等。 (五)质粒的命名原则 1976年提出一种质粒命名的原则，用小写字母p代表质粒，在p字母后面用两个大写字母代表发现这一质粒的作者或实验室名称。如pUC118, 字母p代表质粒，UC是构建该质粒的研究人员的姓名，118代表构建的一系列质粒的编号。 二、组建理想质粒载体必须具备的条件 (一)质粒拷贝数较高 质粒拷贝数是指生长在标准的培养基条件下，每个细菌细胞中所含有的质粒DNA分子的数目。 根据宿主细胞所含的拷贝数多少，可将质粒分成： 严紧型 松弛型 (二)分子量较小 低分子量的质粒如下优点 (三)带有可供选择的标记 常采用的标记是对某种抗生素的抗性，如氨卞青霉素抗性(Ampr)、卡那霉素抗性(Kanr)、四环素抗性(Tetr)等，而且希望各抗性基因内有若干单一的限制酶切点。 在克隆时通过单一酶切点插入外源基因，使该抗性基因失活、宿主菌变为对该抗生素敏感的菌株，这样较易检查到克隆是否成功。 β-半乳糖苷酶筛选系统： 载体上带有一个来自大肠杆菌的lac操纵子的DNA区段，这一区段编码β-半乳糖苷酶氨基端的一个蛋白片段。IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)可以诱导该片段的合成，而该片段能与宿主细胞所编码的β-半乳糖苷酶羧基端的一个蛋白片段互补(α-互补)。故暴露于诱导物IPTG的细菌含有编码lacZ的质粒可同时合成该酶的两种片段，该菌在其生色底物X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-半乳糖苷)的培养基上生长，将形成蓝色茵落。将一连串克隆位点克隆入β-半乳糖苷酶氨基端的基因中，外源DNA插入质粒的多克隆位点后可使β-半乳糖苷酶的氨基端片段灭活，从而破坏了α-互补作用。因此，带有重组质粒的细菌将产生白色菌落。利用这种筛选方法可方便地将含目的基因的重组子从空载体中筛选出来。 (四)带有尽可能多的单一限制性酶切位点 单一的限制性酶切位点可供外源DNA定点插入； 较多不同的单一限制酿酶切位点，可有选择地供带有不同末端的外源基因插入。目前常用载体上的多克隆位点(MCS)即具有该功能。 (五)具有复制起始点(origin, ori) 这是质粒自我增殖所必不可少的基本条件，也是决定质粒拷贝数的重要元件．可使繁殖后的细胞维持一定数量的质粒拷贝数。 例如含ColE1或pMB1复制起始点的质粒即为松弛型质粒。 在一般情况下，一个质粒只含有一个复制起始点，构成一个独立的复制子。穿梭质粒含有两个复制子，一个是原核生物复制子、另一为真核生物复制子，以确保其在两类细胞中均能得到扩增。 三、常用的质粒载体 (一)克隆载体 p