第六章PCR引物设计58.pptVIP

第六章 PCR引物设计及相关软件使用 主要内容 引物设计原理 引物设计的优化原则 Primer Premier 5.0 介绍 举例说明引物的设计 引物设计原理 引物设计的目的是为了找到一对合适的核苷酸片段，使其能有效地扩增模板DNA序列。引物设计总体上包含三个程序：序列下载，同源性比较，引物设计筛选 。 引物设计的原则 1、引物长度 大多数应用的最短引物长度为18个核苷酸。如果期待的产物长度等于或小于500 bp，选用短的(16～18)的引物；若产物长5 kb，则用24个核苷酸的引 物。有人用20～23个核苷酸引物得到40 kb的产物。 引物设计的原则 2、引物GC含量 GC含量在40%－60%之间，以45-55％为宜。这可为有效退火提供足够热。 引物设计的原则 3、引物Tm 引物所对应模板序列的Tm 值最好72℃左右。至少要在55－80℃之间。 Tm=2(A+T)+4(C+G) （引物长度在25 bp以下） 对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为：Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (%GC) – 600/size 公式中，Size = 引物长度。 引物设计的原则 4、引物3’端 引物3’末端和模板的碱基完全配对 防止一对引物内的同源性 考虑末端5个碱基的ΔG，最好不要富含G/C 引物3′端要避开密码子的第3位 引物设计的原则 5、选择T 引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G、C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T，避免A。 引物设计的原则 6、最好在模板cDNA的保守区内设计 DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。 引物设计的原则 7、引物自身及引物之间不应存在互补序 列 引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。 引物设计的原则 8、碱基要随机分布 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列（不应超过3个连续的G或C ），否则容易导致错误引发（False priming）。 引物设计的原则 9、引物应具有特异性 引物设计完成以后，应对其进行检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。 引物设计的原则 10、ΔG值 ΔG值(自由能)反映了引物与模板结合的强弱程度。一般情况下，引物的ΔG值最好呈正弦曲线形状，即5’端和中间ΔG值较高，而3’端ΔG值相对较低，且不要超过9（ΔG值为负值，这里取绝对值），如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发。 引物设计的原则 11、引物的5′端 引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰，引物5′ 端修饰包括：加酶切位点、标记生物素、荧光、地高辛等；引入蛋白质结合DNA序列；引入点突变、插入突变、缺失突变序列；引入启动子序列等。 引物设计的原则 12、在DNA测序和PCR中最好用5′末端稳定(如GC含量较多)，而3′末端不太稳定(如AT含量较多)的引物 Primer Premier 5.0 简介 Primer Premier 5.0使用介绍 Load sequence 基本信息 引物设计界面 引物搜索选项设定 搜索结果 引物信息 引物编辑 引物编辑 引物要求 PCR扩增GFP GFP两边添加BamHI酶切位点 保证NR1的阅读框不改变 第二步：GC比值；Tm值 第三步：酶切位点 第五步 保护序列 Primer1: 5’ GCGGggatccTATGGTGAGCAAGGGCGAGGA Primer2: 5’ GCGCggatccctCTTGTACAGCTCGTCCATGCC ATGGTGAGCAAG GGCGAGGAGC TGTTCACCGG GGTGGTGCCC ATCCTGGTCG AGCTGGACGG CGACGTAAAC GGCCACAAGT TCAGCGTGTC CGGCGAGGGC GAGGGCGATG CCACCTACGG CAAGCTGACC CTGAAGTTCA TCTGCACCAC CGGCAAGCTG CCCGTGCCCT GGCCCACCCT CGTGACCACC TTCGGCTACG GCCTGCAGTG CTTCGCCC