米曲霉氨基酰化酶纯化方法的研究论文.pdfVIP

发酵工程学科的进展 ——第四次全国发酵=r-S[学术讨论会论文集 米曲霉氨基酰化酶纯化方法的研究 张媛媛，张伟国 (江南大学生物工程学院，无锡214036) 摘要：比较了盐析法和有机溶剂沉淀法对于米曲零氨基酰化酶的纯化效果．分别使用硫 酸铵、无水乙醇和丙酮对米曲零氨基酰化酶进行纯化，结果发现，有机溶剂沉淀法的纯化效 果优于盐析法。采用丙酮二次沉淀法纯化的氨基酰化酶比酶活为93．20U／mg，纯化倍数为 3．26；通过乙哼二次沉淀，得到的酶液比酶活为93．22U／mg，纯化倍数为3．10，而采用盐析 法纯化的酶液的比酶活为56．01U／rag，纯化倍数为2．06。从酶的纯化效果方面考虑，丙酮 沉淀法最佳，但从工业生产的可行性方面考虑，乙醇沉淀法较好。 关键词：氨基酰化酶，硫酸铵沉淀；乙醇沉淀，丙酮沉淀 胺键，获得L-氨基酸，反应物中留下的肛氨基酸可用化学方法消旋后继续拆分。这一方 法几乎适于所有合成法生产的DL-氨基酸的拆分。氨基酰化酶的来源广泛，存在于各种 动物和植物的器官以及微生物胞内或发酵液中。1957年Chibata等发现米曲霉的发酵 液中有氨基酰化酶存在，从而开始了利用微生物发酵法制备氨基酰化酶[13。由于游离态 氨基酰化酶存在性质不稳定、易失活、不能重复利用等缺点c2]，固定化氨基酰化酶被广泛 应用于生产。米曲霉氨基酰化酶的固定化要经过酶蛋白的提取、纯化和固定化三个阶 段，其中，选择合适的酶蛋白纯化手段对于简化纯化工艺和后续的固定化操作都很有意 义． 蛋白质的分离纯化方法主要有沉淀法、层析法、电泳法和超速离心法，后三种方法主 要用于酶蛋白的精制[3]，而沉淀法主要用于酶蛋白的初步纯化。沉淀法又分为盐析法和 有机溶剂沉淀法。盐析法操作简便，不需要低温，盐析所得沉淀，用透析、凝胶过滤或超 滤方法将盐除去之后，酶蛋白可以恢复其天然状态，所以目前氨基酰化酶的工业纯化方 法主要是盐析法。有机溶剂沉淀法与盐析法相比，其后处理简单，不需再经过透析除盐 等操作，缩短了生产周期，乙醇、丙酮等有机溶剂，可以通过回收装置回收利用，节约了生 产成本。但有机溶剂沉淀法也存在需要在低温下操作、酶蛋白与有机溶剂接触时间不宜 s．M 过长的缺点。国内对有机溶剂沉淀法纯化氨基酰化酶的研究不多，国外Birnbaum 等人曾利用丙酮分级沉淀从新鲜猪肾中分离纯化得到氨基酰化酶制品“．s】。本文研究并 比较了盐析法和有机溶剂法在纯化氨基酰化酶上的应用。 1材料和方法 1．1菌种 作者简介：张嫒嫒(1983一)，女，江南大学硕士研究生．Email：zhyy—jay(勇163．tom． 张嫒嫒等：米曲霉氨基酰化酶纯化方法的研究 581 米曲霉L—09，由本实验室选育保藏。 1．2培养基 1．2．1黄豆汁琼脂培养基 0．19，K2HPo‘0．0729，琼脂49，pH自然。 MgSO‘·7H20 1．2．2固体培养基 麸皮：豆饼粉：水=4；1。5，吐温--800．5％，植酸0．05％(以上均为质量比)，pH 自然。 1．3主要原料及仪器 司 721型分光光度计 H．H．S型电热恒温水浴锅 SHz_DⅢ型循环水真空泵 CR22G型冷冻高速离心机 79—1型磁力加热搅拌器 1．4．实验方法· 1．4．1米曲霉的固态培养 摇床上培养2d。 1．4．2米曲霉氨基酰化酶的提取 取培养好的固体培养基若干克，加入7倍于其质量的蒸馏水，于30℃，100r／min的 摇床上浸1h，纱布过滤，经真空泵抽滤得到粗酶液。 1．4．3酶活测定方法 取0．2mL待测酶液于试管中，依次加入0．4mLpH7。0的磷酸缓冲液，0。2mL(0． 15mmol／L)CoCi2，0．2mL 沸水浴5min中止酶活，待冷却后加入lmL 显色剂，沸水浴15min，冷却，加入amC60％(体积分数)的乙醇溶液，在570nm下比色， 得到其吸光度值，并由标准曲线计算出待测酶液中蛋氨酸的含量。对照溶液需先