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藻类基因工程研究 王潮岗 藻类基因工程研究的意义 藻类基因工程研究的历史 遗传转化的的理论基础 常见的遗传转化方法 遗传转化中常用的筛选标记 已建立遗传转化模型的藻类 转基因藻的应用前景 转基因藻的检测 一、藻类基因工程研究的意义 你所知道的藻类？ 我们肉眼可见的如：海带、紫菜、浒苔等。肉眼不可见的更多，如：硅藻、衣藻、微囊藻等。 淡水中分布的微囊藻、平裂藻、颤藻、小球藻等；海水中分布的海带、紫菜、裙带藻、龙须菜等；陆地上分布的发菜（念球藻）。 种类繁多、分布广泛。 水体占地球表面积的70%以上，水体中存在大量的藻类，任何时候都保持在6.25×1025个； 它们提供了大气中40-50%的氧，是水体中最重要的初级生产力，将太阳能转化成化学能； 藻类就如同陆地上的果蔬、草和森林，为水体中的鱼、虾、蟹和贝类等各种水生生物提供食物，处于食物链的最底层。 藻类是我们生存环境中非常重要的组成，研究清楚和利用好藻类资源对人类的生存和发展非常重要。 二、藻类基因工程研究的历史 早在1850年就有人开始研究藻类的培养，有非常悠久的历史； 1970年就有证明DNA可以进入单细胞蓝藻-聚球藻。后来的研究也表明此类原核微藻具有类似细菌的质粒DNA; 1982年实现了莱茵衣藻的遗传转化，现在它已成为唯一可进行核、叶绿体和线粒体三套基因组遗传转化的光合生物； 在90年代，以海带为代表的大型海藻基因工程研究得到了快速的发展. 1.定义 藻类基因工程：利用DNA重组技术，根据研究目的将外源或内源基因通过一定的技术手段整合到藻类的基因组中，获得藻类新品种，或是表达特定的目的基因，它包括目的基因的克隆、转移外源基因所需载体的构建、外源基因的遗传转化技术和检测方法的建立等。最终实现特定蛋白、疫苗和次生代谢产物等有价值产品的生产，它是一种现代的、崭新的、分子水平的生物工程技术。 2. 优势 它可作为生物活性基因和抗逆基因的来源； 蓝藻、红藻中发现的质粒有可能改造成基因工程的载体，用于外源基因的表达研究； 衣藻、聚球藻等模式生物遗传背景清晰、基因工程技术成熟，可以作为研究其他藻类的平台； 由于密码子的偏好型和启动子的通用性，藻类有可能成为植物基因表达的反应器； 海洋生物中发现了大量具有价值的药物，可利用微藻进行大规模的生产； 多种经济藻类已具备相当的养殖规模，转基因藻已具备产业化条件(螺旋藻、红球藻、小球藻、海带、紫菜等). 1.外源基因的整合原理 外源基因一般通过同源片段的双交换,定点整合到基因组中。在表达载体中引入同源片段,当载体通过一定的方法被导入藻细胞时,同源片段完全或几乎完全取代受体基因组上的同源区域,外源基因也随之插入到基因组的特定位点。 也可通过单交换整合进基因组中； 还可以通过转座子随机整合进入基因组中。 当某一单拷贝基因插入某一染色体中时,其整合位置可能有如下几种: (1)整合进染色体上基因的调控序列; (2)整合到染色体上任一基因中, 处于内含子中或内含子外。 (3)无义序列 外源基因整合进细胞质时,其整合位置也有2种,即: (1)整合进叶绿体ＤＮＡ中; (2)整合进线粒体ＤＮＡ中。 四、常见的遗传转化方法 基因枪法 :它的基本原理是用外力（氦气）为包含有外源DNA的金属微粒 (金粉或钨粉 )加速使其获得极高的速度，然后轰击植物材料 ,金属颗粒进入细胞的同时也把外源DNA导入植物细胞里。该法的特点：简单，可重复性好；多拷贝克隆；随机整合；需要昂贵的仪器；对宿主的选择性不大。 玻璃珠搅拌法 :它的原理是小玻璃珠（石英砂）和衣藻细胞共振荡，然后利用玻璃珠产生的瞬间剪切力快速撕开衣藻的细胞膜，从而导入外源基因。该法的特点：廉价，不需要特别的仪器；转化频率不高；整合基因的拷贝数低；需要去除细胞壁。 电穿孔法 :它是利用脉冲电场改变细胞膜的状态和通透性,形成可逆的瞬间通道，外源DNA通过通道进入细胞。它的操作简单快速，转化率较高，常用于细菌，植物和动物细胞的转化、融合实验中。 激光微束穿孔法 :激光是一种很强的单色电磁辐射,一定波长的激光束经聚焦后可引起膜的可逆性穿孔。具体做法是:在荧光显微镜下找出适当的细胞,然后用激光光源替代荧光光源,聚焦后发出激光微束脉冲,击穿细胞壁,使DNA分子进入细胞。由于激光孔径小,为线粒体、叶绿体的遗传工程以及细胞质遗传的研究提供了方便的手段。 多聚物介导法 :PEG法是化合物PEG、多聚-Ｌ-鸟氨酸(pLO)、磷酸钙及高pH值的条件下诱导原生质体摄取外源DNA分子。这些多聚物和二价阳离子(如Mg2+,Ca2+,Mn2+)及DNA常常在原生质体表面形成沉淀颗粒,通过原生质体的内吞作用而进入细胞内部。 低能离子束法 :余增亮等在研究低能离子束与细胞表面相互作用的过程中,发现离子束对细胞壁具有刻蚀作用,提出离子束介导转基因的