蛋白质与酶工程5-6.pptVIP

第六章 酶(蛋白质)分子的化学修饰 （蛋白质水平的分子改造） 酶分子的化学修饰就是在体外通过人工的方法将酶分子与一些化学基团或化学物质(修饰试剂 )进行共价连接从而改变酶的结构和性质。 基础研究：①探测酶活性必需氨基酸的性质和数目；②探测酶蛋白的结构变化与功能的关系；③测定酶蛋白部分区域的构象状态；④探索酶的作用机理和催化反应历程；⑤研究酶的固定化技术。 应用研究： ①提高酶的稳定性； ②改善酶的催化特性；③提高蛋白药物在体内不稳性、 消除免疫原性及靶向性（病灶细胞）。 第一节 酶化学修饰的基本条件 必须对被修饰酶的性质、修饰原理、修饰剂和反应条件等方面有足够的了解 一、被修饰酶的性质 1、基本性质 热、酸碱稳定性，最适温度、pH，pI，抑制剂，蛋白酶水解部位等。 2、酶活性中心 氨基酸残基数目、性质及其地位、有无辅助因子及种类。 3、被修饰氨基酸侧链基团的性质及反应性 常被修饰的侧链基团：巯基、氨基、羧基、咪唑基、羟基、酚基、胍基、吲哚基、硫醚基及二硫键等 ①巯基的修饰试剂 烷基化试剂：碘乙酸、碘乙酸胺、巯基乙醇、谷胱甘肽 汞试剂：HgCl2、对氯汞苯甲酸、2-氯汞硝基苯酚 Ellman试剂：5，5’-二硫-二-2-硝基苯甲酸 * 第五章 酶的固定化 游离酶的缺点： ①稳定性差(热、酸碱、有机溶剂对其有影响)； ②不能回收反复使用； ③产物中混杂酶蛋白，分离纯化困难。 酶的固定化 (enzyme immobilization)就是通过吸附、交联、包埋、共价键结合等物理、化学手段将酶被束缚于水不溶的载体上或一定空间内但仍具有酶活性。（上世纪60年代） 酶管、酶膜、酶板 第一节 酶的固定化方法 一、固定化酶的优缺点 1、优点 ①酶与底物、产物易分开，简化了提纯工艺； ②可反复使用，利于连续化、管道化； ③反应过程可控，利于自动化； ④提高了酶的稳定性（绝大多数情况）； ⑤酶的使用效率高、产率高、产品质量高、成本低。 2、缺点 ①损失酶活力 2）②不适应非水溶性底物和大分子底物 ③不适于多酶反应 二、酶的固定化方法 吸附法、共价结合法、交联法、包埋法 1、吸附法 吸附法分为物理吸附法和离子交换吸附法。 ①物理吸附法 通过氢键、疏水作用和、π电子亲和力等物理作用，将酶固定于水不溶载体上，从而制成固定化酶。 常用的载体有： 有机载体：纤维素(玻璃纸或胶棉膜 )、淀粉等，吸附量大 无机载体：氧化铅、皂土、多孔玻璃等，吸附量小，易脱落 ②离子交换吸附法 将酶与含有离子交换基的水不溶载体相结合而达到固定化。 阴离子交换剂：二乙基氨基乙基（DEAE）-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶 DEAE-Sephadex A25固定氨基酰化酶：溶胀，然后用0.5mol/LNaOH和水洗涤，加酶混匀，于低温下搅拌过夜，吸去上清液，再用蒸馏水和0.15mol／L醋酸钠水溶液洗涤固定化酶，置4℃备用。 阳离子交换剂：羧甲基（CM）-纤维素 吸附法的优点：a、操作简单；b、载体选择范围广；c、吸附过程可以同时纯化酶；d、固定化酶在使用过程失活后可重新活化；e、载体可以回收再利用。 吸附法的缺点：a、由于有些机理不十分明了，在给酶量、吸附程度与固定化酶活力回收的关系不可预见性大。b、由于吸附法制备的固定化酶酶易脱落，影响产物纯度和酶的操作稳定性。 2、包理法 包埋法是将载体聚合物的单体与酶溶液混合，再借助于聚合助进剂（包括交联剂）的作用进行单体聚合，酶被包埋在载体聚合物中以达到固定化。 分为凝胶包理法和微囊包埋法 ①凝胶包理法 凝胶包埋法（基质包埋法）是将酶分子包埋在凝胶网络的格子中。 海藻酸钙凝胶（海藻酸钠）、聚丙烯酰胺凝胶、淀粉凝胶、卡拉胶 ②微囊包埋法 微囊包埋法是将酶包埋于具有半透性聚合物膜的微囊内。此法在医疗上极为有用 人造细胞、红血球包埋法、脂质体包埋法…… 包埋法是目前应用最多的一种较理想的方法。 优点：①操作简单，条件温和；②无反应，不改变酶的空间结构，固定化酶的活力高；③适用性广。 缺点： ①只适宜于小分子底物