对虾白斑病毒核糖核苷酸还原酶基因原核表达载体的构建及蛋白表达、纯化.pdf.pdfVIP

第 30卷第 2期 泉州师范学院学报 VoL3ONo．2 2012年 3月 JournalofQuanzhouNormalUniversity M ar．2012 对虾 白斑病毒核糖核苷酸还原酶基因 原核表达载体的构建及蛋 白表达 、纯化 吴文林 ，杨培峰 ，陈宇，陈曦 (泉州师范学院 化学与生命科学学院，福建 泉州 362000) 摘 要：采用 PCR方法扩增对虾白斑病毒核糖核苷酸还原酶基因，插入到 pGEX-4T-2表达载体上构建出 带有 目的基因的重组质粒 pGEX-4T-2RR，然后将重组质粒转化大肠杆菌．转化菌经 IPTG诱导后大量表达重 组蛋白，通过降低诱导温度获得可溶性表达的重组蛋 白，采用GlutathioneSepharose4B亲和层析对重组蛋 白 进行纯化 ，获得了高纯度的 目的蛋白． 关键词：对虾白斑综合症病毒；核糖核苷酸还原酶；表达；纯化 中图分类号：Q575+．12 文献标识码：A 文章编号：1Oo9—8224(2O12)02—0063-04 对虾白斑综合症病毒 (whitespotsyndrome s，WSSV)是对虾的最主要病毒病原之一．该病毒的宿主 范围广 ，传染力强 ，致死率高，难防治，给养殖业造成巨大的经济损失．它是一种新型的外面具包膜无包涵体的 双链环状 DNA杆状病毒．随着WSSV基因组文库的建立及基因组全序列测定的完成，对虾白斑综合症的研 究从早期主要集中在病理学、流行病学及综合防治技术等方面，分子生物学方面的研究主要集 中于快速诊断 技术，发展到对WSsV基因结构和功能的研究[1引．核糖核苷酸还原酶(R60，zc0 Reductases，RR)普遍存 在于细菌、酵母、人细胞和其他细胞系统，是生物体内唯一的催化4种核糖核苷酸还原、生成相应的脱氧核糖 核苷酸的酶．该酶是 DNA合成和修复的关键酶和限速酶 ，对细胞的增殖和分化起着调控作用．其作用是催化 核糖核苷酸中核糖上 C2位的羟基还原成氢，生成脱氧核糖核苷酸．不同生物中的RR根据其结合的金属辅助 因子不同而分类．虽然不同类型RR之间的氨基酸序列相似性很低 ，但它们有十分相似的三级结构的活性中 心和相同的催化功能．RR分子中包含 2个变构位点，即酶活性中心和底物特异结合位点．活性中心通过生物 有机 自由基的作用催化核糖核苷酸还原，底物特异结合位点通过变构作用调控 4种 dNTPs在细胞内的平衡． RR在许多恶性肿瘤中高表达 ，增加 RR的活性与恶性肿瘤的形成和转移密切相关 ，RR不仅能够促进各种致 癌基因的转变，还能提高癌细胞的入侵能力 ，肿瘤细胞对 RR抑制剂的敏感性较正常细胞高．RR酶因此被列 为化疗药物的重要靶点之一 ]．RR抑制剂作为可能的抗肿瘤、抗病毒和抗细菌 的化学疗剂受到广泛重视． 绝大多数基因组较大的DNA病毒能编码一组与核苷酸代谢有关的酶．目前，已知WSSV编码参与核酸代谢 的酶有 3个 ，核糖核苷酸还原酶是其中之一．抑制WSSV中RR的表达水平和活性 ，从而控制 WSSV的复制 和感染 ，可望成为WSSV防治的新思路． 1 材料与方法 1．1 材料 表达质粒 pGEX-4T-2和大肠杆菌 DH5a菌株由本实验室保存 ，引物 1：AAC(GGGATGG：A AAT— CAAACT rr(SmaI)和引物 2：AAo c( 丌 AGATr( Iv]℃AACTGCAG(NOtI)由生工上海有限公 司合成，TaqDNA聚合酶、dNTP、SmaI酶、NotI酶、T4DNA连接酶、蛋 白质标准 marker购 自Ferments， 收稿 日期 ：2011-08-18 作者简介：吴文林(1969一)，男，福建漳州人，副教授，博士，从事海洋生物分子生物学研究． 基金项目：国家 自然科学基金资助项 目；福建省教育厅项 目(JK2009043) 66 泉州师范学院学报 2012年 3月 的早期基因嘲．Lin等的研究表明，在WSSV感染后，这2个基因无论是在RNA水平还是蛋白质水平都显著