使用酶标记的肽模拟表位作为示踪剂利用竞争性免疫分析检测抗原.doc

使用酶标记的肽模拟表位作为示踪剂竞争性免疫分析检测抗原 B13-DE1与荧光素和相应的模拟肽的结合。D 2002 Elsevier科学有限责任公司保留所有解释权。 1.引言 合成肽已被用于科学研究、医药学和生物学等许多不同领域(Van Regenmo¨rtel and Mu¨ller, 1999).。很多实验都是用的肽而不是全蛋白，例如，合成肽在疫苗和免疫分析实验上就应用的非常成功。由于肽的合成价格低廉，因此已经成为一种常规实验方法。因为可以通过已知的DNA序列合成短的肽链，再通过对应的抗体抗原反应可以识别相应的蛋白质，因此目前通过合成肽研究未知基因产物非常热门。另一方面，噬菌体是肽的天然图书馆(Scott and Smith, 1990)，目前，利用合成肽制备单克隆抗体，再通过单克隆抗体鉴定抗原表位应用得非常广泛。在一些情况下，通过合成肽所鉴定的结构并非真正的抗原表位，但可以通过与抗体结合的部位模拟抗体表位。这样的模拟表位还可以检测非蛋白质表位(Bo¨ttger et al., 1999; Kieber-Emmons, 1998;Skerra and Schmidt, 1999)。这些模拟表位还有一些独特的功能，例如，在免疫方面，在一些情况下原始表位很难分离，模拟表位的价值在这里就体现出来了。 模拟表位在代替抗原进行免疫测定方面也非常有价值。利用这种原则设计的的第一法是由“yuan”等人在一次利用免疫法测定霉菌毒素（deoxynivaenol）中提出的（1999）。在这里，我们描述了一个通过半抗原荧光法测定的，单克隆抗体B13-DE1和荧光素、模拟表位肽竞争性结合的，免疫分析实验。 2材料与方法 2.1抗体 此实验所使用的单克隆抗体B13-DE1由我们实验室生产。B13-DE1与荧光素反应强烈，6-羧基荧光素和异硫氰酸（FITC）所标记的蛋白质，与比他们低3个数量级的相关分子结构反应产生酚红色。 2.2合成肽 与单克隆抗体B13-DE1结合的模拟表位肽最初从噬菌体肽库中筛选而来(Bo¨ttger et al., 1999)。这里所使用的肽由Biosyntan（柏林）通过原始的三个模拟表位所合成，含有以下氨基酸序列的肽S-940被用于此次描述性实验，因为它在几个不同实验中都可以与单克隆抗体B13-DE1发生反应：ADGAGSWGEWGA-（之中的下划线序列已由噬菌体证明为模拟表位）。 2.3肽过氧化物酶结合物 根据赫曼森所描述的略作修改后的标准方法（1996）,模拟表位中的N-末端与辣根过氧化物酶（HRP）发生偶联而体现荧光性(HRP; Roche Diagnostics, Mannheim)。0.5mg的肽与1.5mg辣根过氧化物酶偶联。 2.4异硫氰酸（FITC）与牛血清蛋白（BSA）和辣根过氧化物酶（HRP）的偶联作用 根据赫曼森所描述的略作修改后的标准方法（1996）, 牛血清蛋白（BSA）和辣根过氧化物酶（HRP）中的-NH2与荧光素发生偶联（共轭）。1mg的蛋白质与0.2mg的异硫氰酸（TITC）偶联。 2.5竞争性免疫分析 酶联免疫吸附条纹板(Nunc)包被纯化的抗体B13-DE1（每孔加50ml的5mg/ml的PBS培养1夜），用自来水冲洗，并在每孔中加入100ml具有阻遏作用的M-PBS在室温下静置30min，然后每孔加入50ml混合物（预先在室温下放置30min），HRP-肽偶合物（M-PBS 1:500稀释）或者FITC-HRP偶合物以及不同浓度的荧光素或荧光素衍生物，室温下培养4小时，所有条纹上的每个孔用200毫升0.1%的Triton X-100，0.5mol氯化钠，PH为7.5的10nml三羟甲基氨基甲烷试剂冲洗10次。ABTS(罗氏诊断，曼海姆，50毫升/孔)用作检查固相结合过氧化物的底物。20min后将反应物在酶联免疫测定仪405nm波长测定。 2.6含量验证 通过5天内分别重复5次试验间的精密度对实验结果进行评价。对于检测而言，制备一批更多更新的模拟表位结合物-HRP，比使用第一批精度要有所提高。对于所有的测定，所使用的材料全部相同，包括样品的校准曲线。对于荧光素的含量，是事先由另一个人准备好的4个不同样品进行测定的。其中两个样品选择在测定的校准范围内，两个样品选择在测定的校准范围外。该软件GraphPad Prism是专门为由单独测得的吸光计算吸浓度而设计的，同时还可以对5个实验间的变异系数进行统计分析。 3结果 实验发现对S940-HRP偶合物进行1:500的稀释，可以得到最佳测定浓度。由于S940-HRP偶合物与固相固定抗体B13-DE1的结合受到FITC标记的牛血清蛋白的抑制作用，实验证明未结合的荧光素和各种相关化合物也会产生相同的竞争效应。荧光素作为HRP共轭肽与B13-DE1结合的