AllprepRNA-DNA-miRNA分提试剂盒操作方法及步骤说明书.doc

◆ TRIpure Reagent 抽提指南 ◆ ◆ 使用手册◆ 实验室使用，仅用于体外◆ TRIpure Reagent 抽提指南 ◆ ◆ 使用手册◆ 实验室使用，仅用于体外◆ TRIpure Reagent 抽提指南 ◆ ◆ 使用手册◆ 实验室使用，仅用于体外 目录号：RN适用范围： 适用于提取RNA的总RNA(如购买额外miRNA吸附柱子和配套溶液，还可以将同一个样品的总RNA和miRNA分离并提取，富集miRNA。），不需要使用DNase消化，RNA可直接用于反转录PCR，荧光定量PCR.。 试剂盒组成、储存、稳定性： 试剂盒组成 保存 50次(RN01) 裂解液RLT室温 50 mlWash Solution 1 室温 ml第一次使用前加入2ml无水乙醇 Wash Solution 2/3 室温 10 ml 第一次使用前加入4ml无水乙醇 RNase-free H2O 室温 10 ml室温 5 ml 漂洗液W室温 1ml第一次使用前按说明加指定量乙醇 室温 10 ml室温 吸附柱RA和收集管 室温 本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。储存事项： 所有的溶液应该是澄清的，如果环境温度低时溶液可能形成沉淀，此时不应该直接使用，可在37℃水浴加热几分钟，即可恢复澄清。 不合适的储存于低温（4℃或者－20℃）会造成溶液沉淀，影响使用效果，因此运输和储存均在室温下（15℃－25℃）进行。 避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、PH值变化，各溶液使用后应及时盖紧盖子。 注意事项 所有的离心步骤均在室温完成，使用转速可以达到13,000 rpm的传统台式离心机，如Eppendorf 5415C 或者类似离心机。 x106细胞x106，组织不超过10mg。将来根据样品试验情况增加或者减少处理量。 裂解液RLT Plus Wash solution 1、Wash solution 中含有刺激性化合物，操作时要戴乳胶手套，避免沾染皮肤，眼睛和衣服。若沾染皮肤、眼睛时，要用大量清水或者生理盐水冲洗。/miRNA/RNA提取，请咨询技术人员，可能需要用到其它试剂。 如购买额外miRNA吸附柱子和配套溶液，还可以将同一个样品的总RNA和miRNA分离并提取，富集miRNA。请咨询我们。 关于DNA 的微量残留： 一般说来任何总RNA提取试剂在提取过程中无法完全避免DNA的微量残留本公司的，由于采取了本公司独特的缓冲体系和，如要进行严格的mRNA表达量分析荧光定量PCR我们建议在进行模板和引物的选择时： 选用跨内含子的引物以穿过mRNA中的连接区这样DNA就不能作为模板参与扩增反应。 选择基因组DNA和cDNA上扩增的产物大小不一样的引物对。操作步骤：（实验前请先阅读注意事项） 提示： 第一次使用前请先在漂洗液RW瓶和70%乙醇瓶中加入指定量无水乙醇! 组织培养细胞 收集107悬浮细胞到一个1.5ml离心管，对于贴壁细胞，孔板培养可以直接裂解，细胞瓶培养应该先用胰蛋白酶消化后吹打下来收集。 13，000rpm离心10秒（或者300g离心5分钟），使细胞沉淀下来。完全吸弃上清，留下细胞团，注意不完全弃上清会稀释裂解液导致产量纯度降低。 轻弹管壁将细胞沉淀完全松散重悬，加350μl（5x106细胞）或600μl（5x106-1x107细胞）裂解液RLT Plus，吹打混匀后剧烈振荡秒分裂解。 1x105一般不需要，涡旋振荡一分钟匀浆）。用带针头的一次性 ml(配0.9mm针头) 注射器抽打裂解物 10 次或直到得到满意匀浆结果(或者电动匀浆30秒) ，可以剪切DNA，降低粘稠度和提高产量。接操作步骤项下3。动物组织（例如鼠肝脑） 新鲜组织用解剖刀迅速切成小碎块,加入350μl(20mg组织)或者600μl(20-30mg组织)的裂解液RLT Plus 后电动彻底匀浆。 在液氮中研磨组织成细粉后，取适量组织细粉(20mg/30mg)转入装有350μl/600μl组织裂解液RLT Plus的1.5ml离心管中， 剧烈振荡秒，充分裂解。用带针头的一次性 ml(配0.9mm针头) 注射器抽打裂解物 10 次或直到得到满意匀浆结果(或者电动匀浆30秒) ，可以剪切DNA，降低粘稠度和提高产量。将裂解物13，000rpm离心3分钟,沉淀裂解的碎片或者不溶物，将裂解物上清 接操作步骤项下3。 3,000 rpm离心秒，。）℃度备用。 确保离心后液体全部滤过去，膜上没有残留，如有必要，可以加大离心力和离心时间。 以下步骤为提取RNA步骤： 用微量移液器较精确估计滤过液体积（350μl或者600μl左右，滤过时候损失体积应该减去），加入1.25倍体积的无水乙醇，此时可能出现沉淀，但是不影响提取过程，立即吹