拓扑异构酶抑制剂替尼泊甙抗口腔癌机制的分析.pdfVIP

中文摘要 拓扑异构酶抑制剂替尼泊甙抗口腔癌机制的研究 研究生 李金忠 导师 李宁毅教授 陈万涛教授 摘 要 目的：拓扑异构酶II在生物体内普遍存在，对细胞的DNA复制、转录，染色体 的凝集和分离具有重要的作用，在增殖期细胞尤其是肿瘤细胞中表达增高，因而 拓扑异构酶II成为抗肿瘤药物的理想靶点。体外化疗药物敏感试验显示拓扑异 构酶(Topo)抑制剂替尼泊甙(Ⅷ一26)对口腔恶性肿瘤的生长抑制作用显著优 于目前常用化疗药物如顺铂、平阳霉素等。本研究目的是探讨替尼泊甙体内、外 抑制口腔癌细胞增殖作用效果和作用机制，为该药物临床应用提供实验依据，并 为寻求同类新药提供技术资料。 材料与方法：以人舌鳞癌Tea8113细胞系和人腭部小涎腺腺样囊性癌肺高转移 ACC．M细胞株为研究对象。使用MTT检测法定量检测不同浓度VM一26及顺铂 细胞和ACC—M细胞按～定密度接种于96孔板，在培养液中分别加入0．199／ml、 d、2 d、4d、5 d、3 d，然后加 1I．tg／ml、399／ml、91-lg／ml的CDDP，继续培养l 入MTT，形成结晶后，以二甲基亚砜(DMsO)充分溶解结晶，酶联酶标检测 SPF级条件饲养，称重后分层随机分为两大组，每组18只。一组每只右侧腋下 部的皮下接种Tea8113细胞移植瘤组织块约8mm3大小；另一组每只于左侧腋下 部皮下接种ACC—M细胞移植瘤组织块8mm3大小。7天后．两组动物分别随机 分为三个亚组：对照组、VM-26处理组和CDDP处理组：每组6只。每亚组动 中文摘要 剂量为5mg∥次，每3天用药1次，共3次。每3天记录肿瘤大小和动物的一 般情况。用药35天后引颈处死动物，称量动物体重和瘤重。 选择Tca8113细胞为实验对象，进行VM一26作用机理研究。先使用荧光染 色法观察VM．26作用下细胞生存情况，在Tca8113细胞培养液中分别加入 d、2d、3d、4d、5 续培养l d，然后加入EB／AO荧光染料染色细胞，荧光显微 镜观察细胞生存情况，并照相；收集同法处理的Tca8113细胞、以2％戊二醛磷 酸盐固定液等固定、脱水包埋、超薄切片、醛酸铀和柠檬酸铅双染色，透射电镜 观察其超微结构下的形态变化，照相记录。收集0．15“劝叫，1．5蚓ml，5．0pgml 13细胞，PBS漂洗，预冷的70％PBS 和15蚓ml浓度VM．26作用48h后的Tca81 后，流式细胞仪检测其细胞周期分布。以AnnexinV试剂处理上述VM-26干预 使用流式细胞仪检测其细胞周期分布和凋亡率。实验重复3次，取平均值，均数 间比较采用t检验，p0．05时有显著性差异。 作用Tea8113细胞72 动物的对照组、VM一26处理组和顺铂处理组的平均肿瘤体积分别为3146．50mm3、 瘤的抑制率分别为72．45％、39．65％。两处理组动物未见严重的不良反应发生。 荧光染色可直观地表现出Tca8113细胞随VM．26浓度的上升和作用时间的延长 诱导凋亡程度加强。TEM观察可见大部分细胞核浆比例变小，核质浓缩，核膜 皱缩，同时染色质固缩，呈块状或新月形位于核膜下．细胞膜结构完整，呈现典 型的细胞凋亡形态。流式细胞仪检测结果表明，5．0蚓ml和15pg，ml浓度的VM．26 中文摘要 处理Yca8113细胞可产生明显的细胞凋亡，48h后细胞凋亡率均分别可达77．5％ 和81．2％，细胞由G1／G0期逐渐聚集于s期，表现为G1／G0期蜂逐渐向二倍体 和四倍体之间移动并停止在二者中间，同时峰高度变低，基底逐渐增宽，显示此 13细胞的 时细胞内DNA含量不均一；0．159