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核酸提取及琼脂糖电泳
核酸提取及琼脂糖电泳
核酸是遗传信息的载体,是最重要
的生物信息分子,是分子生物学研
究的主要对象,因此核酸的提取是
分子生物学实验技术中最重要、最
基本的操作 。
DNA提取的几种方法
染色体DNA的提取
CTAB法
SDS法
其它
基因组DNA -CTAB法
CTAB法原理(植物DNA提取经典方法)
CTAB (hexadecyltrimethylammonium bromide,十六烷基三甲基
溴化铵),是一种阳离子去污剂,可溶解细胞膜,并与核酸形成复合
物。
该复合物在高盐溶液中(0.7mol/L NaCl)是可溶的,通过有机溶剂
抽提,去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离
出来。
注:CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出,因此在将其加入冰冷的
植物材料之前必须预热,且离心时温度不要低于15℃。
基因组DNA -CTAB法
CTAB提取缓冲液的经典配方
TrisTris--HClHCl EDTAEDTA
组份组份 ((pH8.0pH8.0 ((pH8.0pH8.0 NaClNaCl CTABCTAB ββ --巯基乙醇巯基乙醇
)) ))
0.1%0.1%
终浓度终浓度 100100 mMmM 2020 mMmM 1.4M1.4M 2%(W/V)2%(W/V) ((V/VV/V ))使使
用前加入用前加入
Tris-HCl (pH8.0)提供一个缓冲环境,防止核酸被破坏;
EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子,抑制DNase活性;
NaCl 提供一个高盐环境,使DNA充分溶解,存在于液相中;
CTAB溶解细胞膜,并结合核酸,使核酸便于分离;
β-巯基乙醇是抗氧化剂,有效地防止酚氧化成醌,避免褐变,使酚容易去除
CTAB提取缓冲液的改进配方
TrisTris--HClHCl EDTAEDTA
组份组份 ((pH8.0pH8.0 ((pH8.0pH8.0 NaClNaCl CTABCTAB PVP40PVP40 ββ --巯基乙醇巯基乙醇
)) ))
2%2% ((V/VV/V ))
终浓度终浓度 100100 mMmM 2020 mMmM 1.4M1.4M 3%(W/V)3%(W/V) 5%(W/V)5%(W/V)
使用前加入使用前加入
PVP (聚乙烯吡咯烷酮)是酚的络合物,能与多酚形成一种不溶的
络合物质,有效去除多酚,减少DNA中酚的污染;同时它也能和多
糖结合,有效去除多糖。
CTAB法流程图
植物材料 裂解液 酒精沉淀
液氮研磨 抽提 离心洗涤 DNA溶液
细胞裂解 上层溶液 干燥溶解
基因组DNA -SDS法
SDS法原理
SDS是一种阴离子去垢剂,在高温 (55~65℃)条件下能裂解细
胞,使染色体离析,蛋白变性,释放出核酸;
提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度 (冰浴),使蛋白质及多糖
杂质沉淀,离心后除去沉淀;
上清液中的DNA用酚/氯仿抽提,反复抽提后用乙醇沉淀水相中的
DNA。
SDS法DNA提取缓冲液
TrisT
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