核酸提取及琼脂糖电泳.pdf

核酸提取及琼脂糖电泳 核酸是遗传信息的载体，是最重要 的生物信息分子，是分子生物学研 究的主要对象，因此核酸的提取是 分子生物学实验技术中最重要、最 基本的操作 。 DNA提取的几种方法  染色体DNA的提取  CTAB法  SDS法  其它 基因组DNA －CTAB法  CTAB法原理（植物DNA提取经典方法）  CTAB （hexadecyltrimethylammonium bromide，十六烷基三甲基 溴化铵），是一种阳离子去污剂，可溶解细胞膜，并与核酸形成复合 物。  该复合物在高盐溶液中（0.7mol/L NaCl）是可溶的，通过有机溶剂 抽提，去除蛋白、多糖、酚类等杂质后加入乙醇沉淀即可使核酸分离 出来。 注：CTAB溶液在低于15℃时会形成沉淀析出，因此在将其加入冰冷的 植物材料之前必须预热，且离心时温度不要低于15℃。 基因组DNA －CTAB法  CTAB提取缓冲液的经典配方 TrisTris--HClHCl EDTAEDTA 组份组份 （（pH8.0pH8.0 （（pH8.0pH8.0 NaClNaCl CTABCTAB ββ --巯基乙醇巯基乙醇 ）） ）） 0.1%0.1% 终浓度终浓度 100100 mMmM 2020 mMmM 1.4M1.4M 2%(W/V)2%(W/V) （（V/VV/V ））使使 用前加入用前加入  Tris-HCl （pH8.0）提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏；  EDTA螯合Mg2+或Mn2+离子，抑制DNase活性；  NaCl 提供一个高盐环境，使DNA充分溶解，存在于液相中；  CTAB溶解细胞膜，并结合核酸，使核酸便于分离；  β-巯基乙醇是抗氧化剂，有效地防止酚氧化成醌，避免褐变，使酚容易去除  CTAB提取缓冲液的改进配方 TrisTris--HClHCl EDTAEDTA 组份组份 （（pH8.0pH8.0 （（pH8.0pH8.0 NaClNaCl CTABCTAB PVP40PVP40 ββ --巯基乙醇巯基乙醇 ）） ）） 2%2% （（V/VV/V ）） 终浓度终浓度 100100 mMmM 2020 mMmM 1.4M1.4M 3%(W/V)3%(W/V) 5%(W/V)5%(W/V) 使用前加入使用前加入  PVP （聚乙烯吡咯烷酮）是酚的络合物，能与多酚形成一种不溶的 络合物质，有效去除多酚，减少DNA中酚的污染；同时它也能和多 糖结合，有效去除多糖。  CTAB法流程图 植物材料 裂解液 酒精沉淀 液氮研磨 抽提 离心洗涤 DNA溶液 细胞裂解 上层溶液 干燥溶解 基因组DNA －SDS法  SDS法原理  SDS是一种阴离子去垢剂，在高温 （55～65℃）条件下能裂解细 胞，使染色体离析，蛋白变性，释放出核酸；  提高盐(KAc或NH4Ac)浓度并降低温度 （冰浴），使蛋白质及多糖 杂质沉淀，离心后除去沉淀；  上清液中的DNA用酚/氯仿抽提，反复抽提后用乙醇沉淀水相中的 DNA。  SDS法DNA提取缓冲液 TrisT