罗田甜柿乙醇脱氢酶Adh基因片段的克隆和序列分析.pdfVIP

罗田甜柿乙醇脱氢酶（Adh ）基因片段的 克隆和序列分析1 杜晓云，张青林，罗正荣 华中农业大学园艺植物生物学教育部重点实验室，武汉（430070 ） E-mail ：luozhr@ 摘 要：利用同源克隆法首次从柿基因组中克隆到乙醇脱氢酶基因的部分片段，命名为 DKAdh 1。测序及序列分析表明，克隆片段长1,305bp，类典型的10外显子、9 内含子双子叶 植物乙醇脱氢酶基因结构，包含714bp的外显子序列和591bp的内含子序列，编码238个氨基 酸；氨基酸多序列比对结果显示，该序列与不同植物物种乙醇脱氢酶有很高同源性，介于80.3 ％-86.2 ％间；系统进化分析进一步表明，柿乙醇脱氢酶基因与蔷薇科植物的亲缘关系更近 一些，二者可能由同一个祖先基因沿两条不同路径进化。 关键词：柿；乙醇脱氢酶基因；克隆 1. 前言 根据果实能否自然脱涩以及种子与果实脱涩和果肉褐斑形成的关系，柿品种通常分为完 全甜柿（Pollination-constant nonastringent, PCNA ），不完全甜柿（Pollination-variant nonastringent, PVNA ），不完全涩柿（Pollination-variant astringent, PVA ），完全涩柿（Pollination -constant astringent, PCA ）。完全甜柿因不需任何人工脱涩处理即可脆食而较其它三类非完全 甜柿（包括PVNA 、PVA 、PCA ）具有更高的经济价值。完全甜柿和非完全甜柿具有不同脱 涩机理，前者的自然脱涩主要为单宁细胞早期停止发育导致，后者脱涩则主要涉及乙醛作用 下可溶性单宁转化为不溶性单宁的过程（Taira et al.1992）。 罗田甜柿是我国原产完全甜柿。自1982 年在我国湖北大别山区被发现以来，因其独特 的自然脱涩特点，吸引研究者对其展开了大量的研究工作（Guo et al.2006；Ikegami et al.2006； Yonemori et al.2003；Kanzaki et al.2001）。有关罗田甜柿脱涩与单宁细胞发育停止和单宁生 物合成过程中一些关键酶基因表达间的关系已有系列研究报道（Ikegami et al.2005a；Ikegami et al.2005b；Ikegami et al.2007）。综合现有研究结果我们推测罗田甜柿自然脱涩可能兼有完 全甜柿和非完全涩柿脱涩特点，而与单宁细胞凝固有更加密切的关系，但还缺乏直接的证据。 柿单宁凝固与乙醛作用相关，而乙醇脱氢酶（Adh ）是乙醛生物合成的关键酶之一（Yamada et al.2002）。本研究试图克隆柿乙醇脱氢酶基因，以期为进一步从单宁凝固的角度探讨罗田 甜柿自然脱涩的分子机理提供科学依据。 2. 材料与方法 2.1 试材 试验所用材料为中国原产完全甜柿罗田甜柿（Diospyros kaki Thunb.‘Luotiantianshi’ ， 2n=6X=90 ），采自华中农业大学柿圃。 2.2 方法 基因组DNA 提取采用CTAB 法，参考Luo 等（1995）。 1本课题得到国家自然科学基金（No.）的资助。 -1- 2.3 Adh 基因片段的PCR 扩增与测序 简并PCR 引物设计根据GenBank 登录的其它双子叶植物（十字花科Brassicaceae 、豆科 Fabaceae 、茄科Solanaceae、蔷薇科Rosaceae 、芍药科Paeoniacea 和矮牵牛属Petunia ）Adh 基因家族的保守功能结构域DVYFWEAK 和DHVCEFA （两引物分别锚定Adh 基因的第二 和第八外显子末端），引物序列为： 上游引物（Adhex2 ）：5’-GATGTTTAYTTYTGGGAGGCYAAG-3’ 下游引物（Adhex8 ）：5’-ATCAT