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HPLC方法开发基础知识 周瑾 周瑾 2015.10.25 色谱定义  色谱又称色层法或层析法，是一种物理化 学分析方法，它利用不同溶质 （样品） 固定相和流动相之间的作用力 （分配、吸 附附、、离子交换等离子交换等））的差别的差别，，当两相做相对当两相做相对 移动时，各溶质在两相间进行多次平衡， 使各溶质达到相互分离。 色谱分类  按固定相分类  柱色谱、纸色谱、薄层色谱  按流动相分类按流动相分类  气相色谱  高效液相色谱：正相、反相  超临界流体色谱  离子色谱  电色谱 高效液相色谱分析方法（HPLC）的 基本参数  色谱柱：C8 、C18 、HILIC、手性柱等  流动相：有机相、缓冲液添加剂  柱温：根据色谱柱类型，可能有不同要求  进样量：根据要求，可能为5~100μl5~100μl  流速：一般为0.8~1.5ml/min  波长：需要根据化合物特性确定  样品浓度：需要根据化合物特性及分析目 的确定 好的HPLC分析方法是什么样的  能达到预期的分析目标  稳定的稳定的  能经过方法学验证的  简单易操作的 系统适用性 系统适用性是检测仪器系统是否满足分析方法满足要求的性 能指标，一般有以下几项要求  空白无干扰  理论塔板数  拖尾因子拖尾因子  分离度  灵敏度 （信噪比）  进样精密度 HPLC分析方法的类型  含量检测  含量  溶出  单一或个别杂质检测单一或个别杂质检测  杂质/ 有关物质检测 方法开发的首要目标 根据系统适用性的要求，分析方法开发的首 要目标如下，这是准确定量的基础。  峰形 （理论塔板数、拖尾因子）  分离度分离度  保留时间、峰面积重现性  其他验证项目 HPLC分析方法基本的评价指标 （方法验证项目）  专属性：空白干扰、分离度  精密度：进样精密度、重复性、中间精密 度  线性及范围线性及范围  检测限和定量限  准确度  溶液稳定性  耐用性 对几个问题的讨论 1. 什么情况下需要验证分析方法的定量限？ 2. 系统适用性需要验证吗？ 3. 专属性如果不好怎么办？精密度呢？回收 率呢？耐用性呢？ 4. 如果精密度不能通过验证，可能是什么原 因？回收率呢？ 溶解性 溶解性为待测物质在溶剂中的溶解能力。不 同的晶型可能有不同的溶解性，同一个物质 在不同的溶剂中有不同的溶解性。 Q ：溶解性会影响色谱行为的那些方面？ 质子性溶剂、非质子性溶剂  质子性溶剂是指能提供质子的溶剂，如水、 醇类  非质子性溶剂是指不能提供质子的溶剂， 如乙腈、二甲基亚砜、乙酸乙酯等。 质子性溶剂化学活性一般较非质子性溶剂高。 Q ：溶剂类型可能影响哪些色谱行为？ 稳定性 在HPLC中，稳定性分为两种，一种为化合物本身的稳定 性，另一种为化合物在溶剂中的稳定性。 当化合物本身不稳定时，其溶液一般也不会稳定，分析 时就需要现配现进。有时候，如果知道化合物的降解途径， 可以有针对性的抑制其降解。比如化合物易被氧化时，可以 在溶液中添加维在溶液中添加维CC ，，防止其被氧化防止其被氧化。。 化合物在溶液状态时，由于分子间的运动，其稳定性降 低。由于很多物质其化学活性受到质子的影响，因此在有质 子的环境下，可能会降解，会降解速率加快。因此可以采取 的措施就是使用非质子性溶剂。 另外，如果使用了溶解性能不好的溶剂，溶液在存放过 程中可能会析出，也会造成溶液不稳定。 极性  极性指一根共价键或一个共价分子中电荷 分布的不均匀性。如果电荷分布得不均匀， 则称该键或分子为极性；