沼泽绿牛蛙皮肤抗菌肽的分离纯化与活性检测.pdfVIP

维普资讯 第32卷第 1期 南昌大学学报 (理科版) Vo1．32No．1 2008年2月 JournalofNanchangUniversity(NaturalScience) Feb2008 文章编号：1006一O464(2008)01—0075—05 沼泽绿牛蛙皮肤抗菌肽的分离纯化与活性检测 虞鹏程，李燕燕，涂 琪，简少卿 (南昌大学生命科学学院，江西 南昌 330031) 摘 要：以沼泽绿牛蛙皮肤分泌液为样品，采用 C18反相柱液相色谱，使用线性梯度洗脱方法，参照获得的 fuP— HPLC图谱，对图谱结果分析，按每峰一管收集洗脱液 ，得到分离纯化的活性多肽。用纸片法测定每管的抗菌活性， 对抗菌活性最强的洗脱液进行氨基酸序列测定，查询数据库并进行序列比对，发现与牛蛙抗菌肽RANATUERIN2、 RANATUERIN3有序列相似性 ，推断其可能是沼泽绿牛蛙皮肤分泌液中的抗菌肽。 关键词：沼泽绿牛蛙；皮肤分泌液；抗菌肽；分离纯化 中图分类号：Q74 文献标识码：A 抗菌肽(antimicrobialpeptide)是指广泛存在于 rsiellatarda)购 自中科院水生所。 生物界中的一类生物活性肽 ，富含阳离子氨基酸，一 美国LABCONCO公司 12L型冷冻干燥机，上海 般具有抗细菌或真菌的作用，有些还具有抗原虫、病 安亭科学仪器厂 TGL一16G—A型高速冷冻离心 毒或肿瘤细胞的功能…。抗菌肽具有分子量小、水 机，美国Waters公司DeltaPrep4000型高效液相色 溶性好、抗原性低、热稳定性好、不易产生耐药性、不 谱仪，BondapakC18(30x300mm，151xm)反相柱，美 易被胰蛋白酶水解等特点，是两亲性的广谱抗菌分 国Agilent公司1100型高效液相色谱仪，AlhimaC18 子 J，这使其在耐抗生素病原菌株大量涌现的今天 (4．6×250mm，51xm)反相柱。AppliedBiosystems公 有望成为新一代的临床抗菌药物_3]。 司492cLC型蛋 白质测序仪。 蛙类皮肤裸露、潮湿，易受微生物侵袭，皮肤抗 1．2 方法 菌肽是其先天性防御系统的主要组成部分。2000 1．2．1 分泌液的收集 及其抑菌实验 取沼泽绿 年，Jadvinder Goraya 等 从 北 美 蛙 类 ：Rana 牛蛙，蒸馏水清洗蛙皮，划伤表皮置空气中，每 l0 Luterventris、Ranaberlandieri、RanaPipiens皮肤 中 min7V电压电击背面皮肤腺及耳后腺一次，3h后 分离得到一系列抗菌肽 ；2001年，日本学者 KimJB 收集分泌液，将收集液冷冻干燥。将冷冻干燥后的 等人从 日本棕蛙Ranaornativentris冻干皮提取物中 粉末 2mg溶于 2mL蒸馏水中，混匀。再用 0．45 分离得到6种抗菌肽 ；迄今，已从 700多种两栖类动 Ixm微孔滤膜除菌，用大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、 物(大多为无尾两栖类)中分离获得一百多种两栖 嗜水气单胞菌、迟缓爱得华菌做抑菌试验，抑菌实验 类活性肽，并对其结构与功能进行了研究。本文以 用纸片法，蒸馏水为空白对照，培养基中的菌浓度用 沼泽绿牛蛙 (Ranagrylio)皮肤分泌液为样品，采用 比浊法调为每毫升约 105个 。 C18反相柱，通过分离纯化，试图找出沼泽绿牛蛙皮 1．2．2 凝胶过滤层析分离 分泌液冻干粉溶解于 肤分泌液中的抗菌肽。 超纯水中(浓度 2mg／mL)，4ooor／min离心 15 mi