重组人钙网蛋白的克隆与原核表达.pdfVIP

中国生物工程杂志 China Biotechnology，2008，28(4)：70～73 重组人钙网蛋白的克隆与原核表达木 曹春雨 韩 钰 王艳林 (三峡大学医学院分子生物学研究所 宜昌 443Oo2) 摘要 目的：克隆人钙网蛋白(calreticulin，CRT)并进行原核表达和纯化。方法：采用RT-PCR法 从人非小细胞肺腺癌A549细胞总RNA中克隆人钙网蛋白cDNA，构建CRT原核表达质粒(pET一 15b／CRT)并转化E．coli的Rossetta菌株。IPTG诱导后，表达蛋白在变性条件下经Ni—NTA树脂 亲和层析纯化，然后透析复性。分别用SDS和Western blotting鉴定CRT表达和纯化状态。 结果：从A549细胞总RNA中成功获得人CRT cDNA克隆，重组质粒pET-15b／CRT构建正确。转 化pET-15b／CRT的E coli Rossetta诱导性表达重组人CRT蛋白，该蛋白可经Ni-NTA树脂亲和层 析高度纯化。结论：成功建立了CRT原核表达和纯化的实验方法，该方法为后续的CRT蛋白功 能研究奠定了基础。 关键词 钙网蛋白 原核表达 蛋白纯化 中图分类号 Q786 钙网蛋白(Calreticulin，CRT)是主要存在于内质 细胞株、菌株E．coli DH5a和E．coli Rossetta，质粒pET 网／肌浆网的Ca 结合蛋白，具有细胞内Ca2 稳态调 ． 15b和pcDNA3．1(+)为本研究所保存。 节、蛋白加工、抗原呈递、黏附，类固醇敏感性基因表达 1．1．2 酶和主要试剂 TRIzol总RNA纯化试剂由 调节等多种生物学功能 。近来发现，CRT也是一 Invltrogen公司提供，限制性核酸内切酶、T4 DNA连接 种凋亡细胞膜表面特异的配体信号分子，介导凋亡细 酶、dNTP、RT-PCR及PCR试剂盒由Fermentas公司提 胞的识别、吞噬和清除的生理过程 。新近在抗肿瘤 供，DNA回收试剂盒购自Omega公司，Ni-NTA蛋白纯 研究中发现，蒽环类化疗药物能够快速诱导CRT从肿 化树脂购自Novagen公司，兔抗人 CRT抗体购自 瘤细胞内转位到细胞膜，这些出现在膜上的CRT可被 Stressgen公司，羊抗兔tgG—HRP购自北京中杉金桥公 树突状细胞表面的受体识别，由此导致肿瘤细胞被树 司，其它化学试剂由Sigma等公司提供。PCR引物合成 突状细胞吞噬。在树突状细胞内，肿瘤抗原被加工和 及DNA测序由上海生工公司完成。 提呈，从而激发机体特异性的抗肿瘤免疫应答 ，提示 1．2 方 法 CRT在肿瘤的预防和治疗中重大的潜在应用价值。本 1．2．1 RT—PCR克隆人CRT cDNA 以TRIzol试剂法 实验旨在利用基因重组技术，建立人CRT原核表达和 提取A549细胞总RNA。以此总RNA为模板，Oligo 分离纯化的方法，以便能大量制备高纯度的CRT蛋白， (dT)为引物，经逆转录酶M MLV催化将mRNA反转 为深入研究CRT在肿瘤免疫防治中的应用奠定基础。 录为cDNA第一链。用人CRT特异性PCR引物 (5 端 分别引入限制性内切酶Hind III和Xho I酶切位点)从 1 材料与方法 cDNA第一链中扩增人CRT cDNA序列。引物的碱基 1．1 材 料 序列为：上游引物5 -GGTC cGCcA，I℃cTGcTA 1．1．1 细胞株、菌株和质粒 人非小细胞肺腺癌A549 TCCGTGC，下游引物5 -TGACCTCGAGCAGCTCGTCCT TGG