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家畜传染病学实验指导：炭疽的诊断和防治 实验七 炭疽的诊断和防治 目 的 掌握炭疽实验室诊断的步骤和方法、熟悉炭疽的治疗要点、学会炭疽的预防接种技术。 内容及方法 炭疽病畜的生前检查 流行病学：应了解病畜所在地区以往有无炭疽的发生、流行形式、发病季节、动物种类、发病和死亡情况、采取哪些相应的措施、对尸体如何处理以及近年来炭疽预防接种工作进行等情况。 临诊检查：除精神、食欲、结膜、体温等一般检查外，应特别注意喉部、腹下等处有无肿胀、肿胀的性质，病畜有无疝痛症(应与真疝痛区别)，粪便是否带血。 炭疽的实验室诊断 检验材料的采取 疑为炭疽死亡的动物尸体，通常不作剖检，应先自末梢血管采血涂片镜检，作初步诊断。不进行剖检的尸体可作局部解剖采取小块脾脏，然后将切口用浸透了浓漂白粉液的棉花或纱布堵塞，妥为包装后送检。 2．镜检 取病畜濒死时或刚死亡动物的血液作涂片标本，最好用瑞氏或姬姆萨染色法染色，牛羊炭疽常可见到数量很多的有荚膜炭疽杆菌，单个或成对存在，偶有短链，菌端成方形，荚膜呈深红紫色；猪炭疽要采取病变部淋巴结或渗出液涂片检查。 3．培养检查 无菌采取病畜濒死期或刚死动物的病理材料，直接接种于普通琼脂平板及肉汤中，置37℃培养18～24h，检查有无炭疽杆菌生长。如果检查材料已经陈旧或污染时；可将血液或组织乳剂先放到肉汤中加温65～70℃经10min，杀死无芽胞的细菌，然后吸取0.5m1，接种于普通琼脂平板进行分离培养。 检查生长的菌落，如有疑似炭疽的菌落，则应取得纯培养。为了鉴定分离的细菌为炭疽杆菌，必须接种各种培养基，观察菌体的形态，菌落的形态及生化反应，同时接种实验动物观察菌体的致病能力。炭疽杆菌与伪炭疽杆菌有某些类似之处，可参照表7予以鉴别。 表7 炭疽杆菌与伪炭疽杆菌的鉴别要点 鉴 别 方 法 炭 疽 菌 伪 炭 疽 菌 运动力测定· 高浓度C02下培养子血清培养基上生长物 普通琼脂培养基上生长物 普通肉汤培养物 明胶穿刺培养 羊血琼脂平板培养 发酵杨苷 ·美蓝还原试验 卵磷脂酶 对实验动物致病能力 无 有荚膜 常成长链 不浑浊，无菌膜 倒立松树样生长，液化缓慢 溶血弱或不溶血 发酵缓慢或不发酵 还原缓慢 · 产生量小，为弱阳性 有致病力 一般有运动 无荚膜 ’ 常成短链 常浑浊，有苗膜 无倒立松树样生长，液化常快速 溶血明显 快速发酵 还原快速 蜡样杆菌常呈强阳性，大量产生 大多数没有致病力 上述的试验中，以运动力测定、荚膜形成、致病力，以及卵磷脂酶试验较为重要。 4．串珠试验 炭疽杆菌在适当浓度青霉素溶液作用下，菌体肿大形成串珠，这种反应为炭疽杆菌所特有，因此可用此法与其他需氧芽胞杆菌相鉴别。取培养4～12h的肉汤培养物三管，其中二管各及时加入每毫升含5单位和10单位青霉素溶液0.5ml(最终浓度含0.5和1.0单位)混匀，另一管加生理盐水0.5ml，作为对照。置37℃孵育1～4h(时间过久，串珠继续肿胀，容易破裂)，取出加入20％福尔马林溶液0.5ml，固定10min后，涂片显微镜检查，找到典型串珠状者可判定为炭疽杆菌。 5．Ascoli试验 这是一种热沉淀反应，已被用于检查可疑尸体的感染兽皮、器官和组织中炭疽杆菌(炭疽免疫血清能与炭疽芽胞杆菌的抗原浸出物形成一种沉淀物)。这种试验是有一定特异性，仍在许多国家应用。操作方法，采集1g左右可疑病畜的组织，经研磨碎后，用5～10ml含10％醋酸的碳酸生理盐水稀释，煮沸5min，冷却后过滤即成抗原。然后取一支小试管，加入0.5ml抗炭疽血清，再小心将抗原滤液置于其上，如在15min内，在抗原和血清接触面形成一种环状混浊的沉淀环，则表示阳性反应。本试验应设正常血清和正常组织作对照。 6．炭疽杆菌荚膜荧光抗体染色： (1)抗炭疽杆菌沉淀素荧光抗体的制备 取生物制品厂所生产的炭疽沉淀血清，或用炭疽杆菌免疫家兔制得抗血清，用硫酸铵沉淀提纯所得球蛋白与异硫氰酸荧光素标记。 (2)以病死畜的血液或脾脏涂片，固定后滴加标记过的抗体，满盖玻片，置室温或37℃染色30min，倾去荧光抗体液，采用pH8的PBS浸洗10min(中间换液一次)，最后用蒸馏水轻轻冲洗2次，晾干。 (3)在荧光显微镜下检查，找到菌体周围有发光的荚膜，菌体较暗或不被染色，可判为阳性。如发现不带荚膜而发均匀荧光的杆菌，则不能判定为炭疽杆菌。 炭疽的预防接种和治疗 1．炭疽的预防接种 在疫区对易感染家畜每年应进行炭疽芽胞苗预防注射。炭疽芽胞苗有两种： (1)无毒炭疽芽胞苗 一岁以上的马、牛皮下注射lml，一岁以下的马和牛及猪和绵羊皮下注射0.5ml。但不适用于山