开发常温超高压新方法于环境及食品中微生物的快速 - 旺宏教育基金会.pdf

第十四屆旺宏科學獎 成果報告書 參賽編號：SA14-243 作品名稱：開發常溫超高壓新方法於環境 及食品中微生物的快速精確檢測 姓名：徐碩飛 關鍵字：常溫超高壓、生物多樣性、 食品安全 研究動機與目的 在環境微生物多樣性探勘與食品安全課題中病源菌的研究，目前的方 法限制，仍在難以快速有效的揭露全樣本中的各個體與多型多樣性。 環境中超過九成以上的微生物無法或非常難以培養分離，目前常改以 直接探勘 total DNA取代純系分離培養，但主要限制在每次能處理的樣 本量相當有限而仍難虧全貌。在需求日益增加的食品安全研究中，亦 因複雜的食品組成限制，難以快速的分 離偵測病源菌的存在，常須曠 日費時的篩選分離與純系培養 過程，且經常又會掛一漏萬。 近年來在食品產業，發展了常溫超高壓加工技術，利用常溫下的超高 壓力取代高溫滅菌，以維持商品更大的原始色香味及營養機能特性。 本研究即擬跨領域的開發利用這種簡易便捷的新方法，於生物多樣性 及食品安全的利用。簡言之，以常溫超高壓 快速、大量、並有效的 處理土壤樣本或食品樣本，取得全樣本中的所有微生物的總去氧核醣 核酸成份（total DNA ）後，即可以各種已成熟的PCR 技術放大增幅並 分析其中的所有微生物物種。這種方法將能顯著增益生物多樣性探勘 與食品安全檢測，突破先前以化學破碎樣本細胞方法中的可處理樣本 量有限，與揭露代表性不足等兩方面的限制；這種新方法的另一項好 處在於為物理性破碎取代化學藥劑，對於環境生態保護與操作人員安 全等的環安衛層面也有相當大的附帶好處。 研究設計以土壤、麥麴中生物多樣性，與非包裝飲食品中微生物安全 為實證模式。研究發現並證實，利用常溫 30℃、300 Mpa 超高壓一次 大量的破碎土壤、麥麴與食品樣本並釋出全部所含全部微生物 DNA ， 經以細菌 16s rDNA V3區域與真菌 18s rDNA NS2區域專一引子對放大， 並以變性梯度膠體電泳（denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE ）檢 測微生物多型性，結果顯示此新方法可於農場耕作與休耕中土壤、麥 麴樣品與市售飲品，分別較現行化學分解萃取方法，能得到多達 66% 、50% 、47% 、80%的細菌多樣性，與 166% 、133% 、25% 、66%的 真菌多樣性條帶圖譜的增加，明確顯示本方法之可行性與優異性。 1 背景說明 生物多樣性所提供的豐富遺傳資源與穩定生態環境的功能等，是 永續發展的重要基石。隨著生物科技蓬勃發展，許多研究紛紛以分子 層次對各類環境中的遺傳多樣 性探勘並開拓了前所未見的新視野與 新發現。以環境樣本中微生物多樣性為例，傳統純系篩選培養方法僅 能成功檢視分離不足 10%甚至在某些極端樣本中不足 0.1%的物種。利 用現行分子生物學方法包括 total DNA 定序等，則可大幅提高可篩檢辨 識比例，若再輔以新興的 metagenomics, next generation sequencing (NGS) 等高速高通量技術方法，則成效更彰顯。但是，嚴重的限制因素仍存 在於目前所有慣用的自環境中萃取 DNA 等核酸遺傳物質的方法，都 僅能每次處理極少、極有限的環境樣本，使得代表性與涵蓋面都深受 限制。環境微生物多樣性研究的一個重要前端前提，在於儘可能分離 提取所有樣本中的遺傳物質。目前在抽取微生物遺傳物質 (genomic DNA)時，破壞微生物細胞以釋出遺傳物質之最常用的酵素溶解法，每 次能處理的樣品量極為有限且費時耗工 ，又有化學物質對環境與人員 的潛在威脅。 食品及其加工產品常易受到病原菌的汙染而造成食物中毒，目