actinosynnemamirumdsm43827溶解性多糖单加氧酶的异源表达和 .pdf

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２０１４，３４（７）：１７２３ ＤＯＩ：１０．１３５２３／ｊ．ｃｂ ＡｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａｍｉｒｕｍＤＳＭ４３８２７溶解性多糖 单加氧酶的异源表达和酶学性质表征 施贤卫　张伟涛　张小飞　杨广宇　冯　雁 （上海交通大学生命科学技术学院微生物代谢国家重点实验室　上海　２００２４０） 摘要　溶解性多糖单加氧酶（ｌｙｔｉｃｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｍｏｎｏｏｘｙｇｅｎａｓｅｓ，ＬＰＭＯ）是近年来新发现的一类 作用于结晶多糖（如纤维素和几丁质）的氧化酶；ＬＰＭＯ通过氧化的方式来裂解底物从而有利于水 解酶系进一步作用，获得可溶性寡糖。为获得更多新酶资源，通过 ＰＣＲ方法从Ａｃｔｉｎｏｓｙｎｎｅｍａ ｍｉｒｕｍＤＳＭ４３８２７菌株中成功地克隆了编码 ＬＰＭＯ的基因Ａｍｉｒ＿５３３４；将该基因构建到含麦芽糖 结合蛋白（ｍａｌｔｏｓｅｂｉｎｄｉｎｇｐｒｏｔｅｉｎ，ＭＢＰ）标签的ｐＥＴ２８ａ（＋）载体（ｐＥＴ２８ａＭＢＰ）上，并转化至Ｅ． ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）中进行诱导表达。利用镍柱亲和层析进行纯化，获得融合表达蛋白后，使用Ｆａｃｔｏｒ Ｘａ蛋白酶切除ＭＢＰ标签，最终得到成熟的ＬＰＭＯ（Ａｍ５）。成熟Ａｍ５的预测分子量约为２６ｋＤａ， 等电点为８．３。分析Ａｍ５序列发现，Ａｍ５与同家族中ＬＰＭＯ的序列一致性较低，具有良好的序列 新颖性。酶学性质分析表明Ａｍ５是对几丁质有氧化活性而对纤维素无氧化活性的ＬＰＭＯ；与几 丁质酶协同降解几丁质时可提高几丁质酶６０％的水解效率；吸附实验显示，Ａｍ５对几丁质具有较 强的吸附作用，而对纤维素吸附能力较弱。以上研究表明，Ａｍ５是一种针对几丁质底物具有高效 选择性的新型氧化酶。 关键词　溶解性多糖单加氧酶　融合表达　酶学性质　几丁质 中图分类号　Ｑ７８ 　　纤维素和几丁质是地球上最丰富的两类可再生资 统酶法降解结晶多糖的模式。２０１０年，ＶａａｊｅＫｏｌｓｔａｄ 源，对它们进行开发利用，对于解决目前的资源、环境 研究组首次报道了ＬＰＭＯ是一类作用于结晶多糖的氧 ［１２］ 化酶，其能够通过氧化作用来断裂几丁质（或纤维素） 和能源危机具有重大意义 。但如何高效、环保地降 解纤维素和几丁质是亟需解决的难题。传统的酶法降 的糖苷键，生成氧化的糖链末端和新的非还原糖链端， 解纤维素和几丁质主要是通过糖苷水解酶系来完成 使得结晶底物的结构趋于松散，为之后的糖苷水解酶 ［３］ ［６］ 的，即通过与水分子作用来断裂糖苷键 。而糖苷水 进一步作用提供基础 。ＬＰＭＯ主要分布于两大家族， ［４］ ＡＡ９家族（旧称 ＧＨ６１家族）和ＡＡ１０家族（ＣＢＭ３３家 解酶对于降解底物结晶区域的效率很低 ，这导致了 需要对多糖底物进行化学法或物理法等预处理，将结 族）。ＡＡ９家族 中的 ＬＰＭＯ如来源于 Ｔｈｅｒｍｏａｓｃｕｓ 晶底物转变为无定形底物以提高糖苷水解酶的降解效 ａｕｒａｎｔｉａｃｕｓ的ＴａＧＨ６１Ａ，和来源于Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａｃｒａｓｓａ的 ［７８］ ［５］ ＰｃＧＨ６１Ｄ等，都对纤维素有氧化活性 ；ＡＡ１０家族中 率 。但是对底物结晶区的多重预处理极大地提高了 反应体系的复杂度，限制了生物质的高效利用。 的ＬＰＭＯ功能差异较大，其中来源于Ｓｅｒｒａｔｉａｍａｒｃｅｓｃｅｎｓ 　　 然而，近年来溶解性多糖单加氧酶 （ｌｙｔｉｃ