钙黄绿素（calcein）于环形核酸增幅法（lamp）之 - 家畜卫生试验所.pdf

1 家畜衛試所研報No.46 ：1~8 (2011) 鈣黃綠素 （Calcein ）於環形核酸增幅法 （LAMP ）之應用評估 陳麗璇* 行政院農業委員會家畜衛生試驗所 摘要 環形核酸增幅法 （Loop-mediated Isothermal Amplification, LAMP ）已被廣 泛應用於疾病檢測，若於反應前添加鈣黃綠素 ，可藉由顏色變化區別陰陽性反 應 ，本研究目的為比較不同濃度之鈣黃綠素運用於環形核酸增幅法之效果，結 果顯示 25μM calcein-500 M MnCl2 、50 M calcein-500 M MnCl2 與 75 M calcein-500 M MnCl2 三組搭配均利於肉眼直接辨識。若要同時滿足即時濁度檢測 儀 （Real-time turbidity ）及即時螢光核酸定量儀 （Real-time quantitative PCR ）的 需求，則以25 M calcein-500 M MnCl2 較為適合。 關鍵字：鈣黃綠素 、環形核酸增幅法 前言 素 （Calcein ），可於反應前即加入試劑中，以利於反 應結束時直接以顏色判別陽陰性。原理為先以錳離子 LAMP為Loop-mediated Isothermal Amplification 抑制鈣黃綠素的螢光，當反應進行呈陽性反應時，代 的縮寫，為Notomi等人於2000年所提出的新式增幅 表有大量的焦磷酸根的產生。而焦磷酸根會與鈣黃綠 法[8] ，擁有特異性高、效率佳及快速的優點，可辨認 素競爭錳離子，並同樣形成不可溶的沈澱物。鈣黃綠 目標基因的6段序列以及恆溫進行增幅核酸，可在一 9 素失去錳離子的抑制效果之後，便會接受鎂離子並在 小時內使得數個模板的目標基因增幅至10 ，由於反 365 nm紫外光激發之下散發出螢光，所釋放出之螢 應過程中大量合成核酸，所產生的副產物焦磷酸根會 光約510 nm的波長 ，由原本的橘紅色轉為蘋果綠 與反應試劑中的鎂離子產生不可溶的沈澱物[7] ，因此 [11] 。因此本研究將同時應用於即時濁度檢測儀、分 可藉由肉眼可辨的混濁直接判別反應結果。2004年 光光譜儀（spectrophotometer ）及即時螢光核酸定量 即時偵測濁度儀器的上市，更利於LAMP反應的分析 儀來偵測，以獲得更可靠及敏感性之實驗結果 ，來評 [6] 。LAMP反應的技術已經陸續應用於疾病的檢測， 估鈣黃綠素的應用效果 。 不論DNA或RNA的病原，像是犬小病毒[1] 、流行性感 冒的H5N1病毒[2,3,5] 、西尼羅熱[9]或錦鯉疱疹病 毒[10]等重大動物疾病的檢測，甚至可以進一步以限 材料與方法 制酶切割法輔助應用為multiplex LAMP ，同時檢測2 Tomita等人[11]使用鈣黃綠素與氯化錳的濃度 種不同種別的焦蟲病原[4] 。由於以往LAMP反應之 分別為25μM及500μM ，為了瞭解鈣黃綠素與氯化 DNA產物可高達10-20μg / 25μL ，為一