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第四章 生物制药分离工程实验 实验 1 猪胰蛋白酶的纯化及其活性测定 一、实验目的 （1 ）学习胰蛋白酶的纯化及结晶的基本方法 （2 ）学习用 BAEE 法测定胰蛋白酶活性，并计算提取的胰蛋白酶的比活力 二、实验原理 胰蛋白酶是以无活性的酶原形式存在于动物胰脏中 ，在Ca2+ 的存在下，被肠激酶或有 活性的胰蛋白酶自身激活，从肽链 N -端 Lys 和 Ile 残基之间的肽键断开，失去一段六肽， 分子构象发生改变后转变为有活性的胰蛋白酶。胰蛋白酶原的分子量约为 24000 ，其等电 点约为 8.9 ，胰蛋白酶的分子量为23300 ，其等电点约为10.8 ，最适pH 7.6 ～8.0 ，在pH=3 时最稳定，低于此 pH 时，胰蛋白酶易变性，在 pH5 时易自溶 Ca2+对胰蛋白酶有稳定 作用 胰蛋白酶能催化蛋白质的水解，重金属离子 、有机磷化合物以及从胰脏、卵清和豆类植 物的种子中提取的胰蛋白酶抑制剂，都能抑制胰蛋白酶的水解作用 胰蛋白酶对于由碱性氨 基酸（精氨酸、赖氨酸）的羧基与其他氨基酸的氨基所形成的键具有高度的专一性。此外还 能催化由碱性氨基酸和羧基形成的酰胺键或酯键，其高度专一性仍表现为对碱性氨基酸一端 的选择。胰蛋白酶对这些键的敏感性次序为：酯键 酰胺键 肽键 本实验用人工合成的 N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯 （N-benzoyl-L-arginine ethyl ester ，BAEE ） 为底物测定胰蛋白酶活性 N-苯甲酰-L-精氨酸乙酯 （BAEE ）在碱性条件下，经胰蛋白酶作 用水解去一个乙基生成 N-苯甲酰-L-精氨酸 （BA ）。由于 BAEE 在波长 253nm 处的光吸收值 远远弱于 BA ，因此以加入酶为零点，测定在x 分钟内的递增吸光值，通过酶的定义求出酶 活性 胰蛋白酶的 BAEE 单位定义为：以 BAEE 为底物，在一定反应条件下，每分钟使A253 增加 0.001 的酶量为一个 BAEE 单位 从动物胰脏中提取胰蛋白酶时，一般是用稀酸溶液将胰腺细胞中含有的酶原提取出来， 然后再根据等电点沉淀的原理，调节 pH 以沉淀除去大量的酸性杂蛋白以及非蛋白杂质，再 以硫酸铵分级盐析将胰蛋白酶原等（包括大量糜蛋白酶原和弹性蛋白酶原）沉淀析出。经溶 解后，以极少量活性胰蛋白酶激活，使其酶原转变为有活性的胰蛋白酶（糜蛋白酶和弹性蛋 白酶同时也被激活），被激活的酶溶液再以盐析分级的方法除去糜蛋白酶及弹性蛋白酶等组 分。收集含胰蛋白酶的级分，并用结晶法进一步分离纯化。一般经过 2 ～3 次结晶后，可获得 相当纯的胰蛋白酶，其比活力可达到 8000 ～10000 BAEE 单位/mg 蛋白，甚至更高。如需制 备更纯的制剂，可用上述酶溶液通过亲和层析方法纯化 三、试剂与仪器 1. 试 剂 （1 ）pH4 ～4.5 乙酸酸化水 （2 ）2.5mol/L H SO 2 4 （3 ）2mol/L HCl ，0.01mol/L HCl （4 ）5mol/L NaOH 2mol/L NaOH （5 ）硫酸铵 （6 ）氯化钙 （7 ）0.8mol/L pH 9.0 硼酸缓冲液：取 20mL 0.8mol/L 硼酸溶液，加 80mL 0.2mol/L 四 硼酸钠溶液，混合后，用 pH 计检查校正 （8 ）0.4mol/L pH 9.0 硼酸缓冲液（用“7”稀释 1 倍即可） （9 ）0.2mol/L pH 8.0 硼酸缓冲液：取 70mL 0.2mol/L