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中国科技论文在线 基于免疫荧光法对人工红细胞膜骨架蛋白spectrin 的 定位分析 1 1 2 1 1 1 王莹 ，王翔 ，李遥金 ，刘峰 ，肖科 ，熊延连 1 重庆大学生物工程学院，重庆（400044 ） 2 第三军医大学西南医院，重庆（400038 ） E-mail ：wangying@ 摘 要：本文建立免疫荧光方法对人工红细胞膜蛋白进行荧光定位，从膜结构蛋白角度分析 本实验室构建的人工红细胞，也为血液代用品的评价提供了新的途径。以荧光标记兔抗人免 疫球蛋白为抗体，采用间接免疫荧光染色法对红细胞膜蛋白spectrin αl 原位标记，在激光共 聚焦显微镜下以488nm 蓝光激发荧光，通过对比天然红细胞和人工红细胞的spectrin 分布， 分析人工红细胞的构象和重建的过程。与天然红细胞类似，人工红细胞在膜上有血影蛋白分 布，本实验荧光原位标记结果进一步揭示了人工红细胞的体外构建过程。 关键词：免疫荧光法；人工红细胞；血影蛋白；定位 中图分类号：Q2 1．引言 免疫荧光（Immunofluorescence ，IFT ）是作为一门新兴技术，具有灵敏度高、特异性好、 显色特别、检测速度快和在细胞水平定位准确等传统技术不可比拟的优势，已在现代生物学 [1-3] 和医学领域得到广泛应用 。 血影蛋白（spectrin ）又称收缩蛋白，由α和β亚基构成，具有多个肌动蛋白连接位点。 据[4-7]报道，血影蛋白能为膜双层结构提供力学支持并在成纤维细胞、神经细胞、肌细胞、 淋巴细胞等中参与信号转导。血影蛋白是红细胞膜蛋白最主要的组成成分之一，约占膜提取 蛋白总量的 25-30% ，在维持红细胞形态、保持细胞膜完整性以及调控红细胞携氧等方面发 挥着至关重要的作用[8] 。本课题组提出的基于细胞骨架的红细胞重建，以引入膜骨架蛋白使 其自组装为特点，形成具有天然红细胞力学特性的人工红细胞。因此spectrin 作为红细胞膜 骨架主要蛋白，对其进行原位分析在人工红细胞膜结构鉴定中具有关键作用。 本文运用间接免疫荧光法，对天然红细胞和人工红细胞膜spectrin 蛋白进行原位标记分 析，旨在阐明人工红细胞和天然红细胞在形态及结构等方面的异同。 2 ．材料与方法 2.1 实验材料 2.1.1 细胞来源 天然红细胞 来自查体合格的成年人外周血。 人工红细胞 实验室自制（具体方法见文献[9]） 2.1.2 抗体 兔抗人spectrin α l (H-110) 多克隆Ig G 抗体购自美国SANTA CRUZ 公司 ,标记 异硫氰酸酯荧光素(FITC)的山羊抗兔多克隆Ig G 抗体购自北京中衫金桥公司。 2.2 方法 2.2.1 细胞收集 天然红细胞 取全血100μl 加入1 ml PBS 缓冲液（pH 7.4 ）缓慢混匀，900r/min 离心3min，弃上清。重复洗涤两次。收集红细胞备用。 本课题得到国家自然科学基金（No），重庆市科委科技计划项目攻关项目（No.2006ba5010 ）， 高等学校学科创新引智计划（No.B06023 ），重庆大学大型仪器设备开放基金资助。 -1- 中国科技论文在线 人工红细胞 取人工红细胞悬液200μl 2000r/min 离心5min，弃上清。PBS 缓冲液重复洗 涤两次。收集细胞备用。 2.2.2 细胞的免疫荧光标记 天然红细胞 向样品加入500μl 2% PFA 和500μl 0.0075%戊二醛， 室温固定30min 。等渗PBS 洗涤一次，加入0.03 % Triton X-100 1 ml,处理1min，3700r/min 离心5min，弃上清。PBS 洗涤一次。5% BSA 1 ml 室温封闭40min 。spectrin 抗体溶液（1： 100）500μl 室温摇床孵育4h