银鲫zp3 的表达特征和卵壳zp3 蛋白的分离陈波 - 水生生物学报.pdf

第 29 卷 第 3 期 水 生 生 物 学 报 Vol29 ,No3 2 0 0 5 年 5 月 ACTA HYDROBIOLOGICA SINICA May , 2 0 0 5 银鲫 ZP3 的表达特征和卵壳 ZP3 蛋白的分离 陈　波 　郭 　葳 　桂建芳 ( 中国科学院水生生物研究所 ,淡水生态与生物技术国家重点实验室 ; 中国科学院研究生院 ,武汉 　430072) ( ) 摘要 :克隆得到银鲫 Carassius auratus gibelio ZP3 基因全长 cDNA ,在体外表达出银鲫的 ZP3 融合蛋白,并制备出多抗 血清 ;通过免疫印迹和 RTPCR 分析 ,研究了银鲫 ZP3 在卵子发生过程中的表达特征和在早期发育胚胎中的状态变 化 。研究结果表明 ,银鲫 ZP3 的转录发生在卵黄发生以前 ,而 ZP3 蛋白的翻译起始于卵黄形成阶段 ,且随着卵母细 胞进一步成熟 ,其含量不断增加 。ZP3 蛋白的存在状态在受精后和早期胚胎发育过程中发生了明显变化 。在受精 后 5 —30min 期间 ,抽提液中原始的 ZP3 蛋白带迅速消失 ,取而代之的是分子量大约为 90KD 以及更高分子量的蛋白 带 ;而在受精后 80min 和 8 —16 胞期的胚胎抽提液中 ,二聚体和多聚体复合体蛋白带也相继消失 。这种状态变化意 味着 ZP3 蛋白在卵子受精后有可能与自身或其他蛋白共价结合转变成了二聚体和多聚体 。接着 ,用获得的 ZP3 抗 体作为检测指标 ,通过卵壳蛋白的凝胶分离 ,从卵壳中分离纯化出银鲫 ZP3 蛋白。 关键词 :ZP3 ;银鲫 ;蛋白纯化 ;卵壳 ( ) 中图分类号 :Q25 　　　文献标识码 :A 　　　　　文章编号 2005 　　ZP3 作为哺乳动物卵母细胞透明带的主要蛋白 cDNA 开放阅读框的序列[10] ,设计起始于其 108 位碱 成分之一 ,已被证实具有结合精子并引发顶体反应的 基、并在 5’端引入 EcoRI 和NdeI 酶切位点的正向引物 [ 1 —3 ] ( ) 功能 ,且其O连糖基化侧链在精子结合中起了关 5’GAATTCTCATATGCGCAGCCAAAGTCCAAGC 3’,设计 键作用[4 ,5 ] 。迄今已有许多脊椎动物的 ZP3 基因已经 起始于其 395 位、并引入有 Hind Ⅲ和BamH Ⅰ酶切位点 被克隆 ,并且具有类似的特征[6 ] 。鱼类的 ZP3 基因 ( 的反 向引物 5 ’GGATCCTTAAAGCTTACTGCATTGAAC 已在青鱼将[7 ] 、鲤[8 ] 、斑马鱼[9 ] 、银鲫和彩鲫[ 10 ] 中克隆 ) ( ) A GCCAC3 ’,采用高保真酶 Pyrobest Katara 从银鲫 到 ,并被证明是构成卵壳的主要蛋白之一 。 卵母细胞 cDNA 文库[ 11 —13 ] 中扩增其 cDNA 片段 ;将 作者在进行