反相色谱法reversed phase hplc.ppt

HPLC日常维护（二） ——色谱柱的使用和维护 * * 高效液相色谱法(HPLC)基本原理 一、高效液相色谱法与气相色谱法比较 ① 分析对象： 气相色谱法只能分析气体和沸点较低的化合 物； 沸点高、热稳定性差、摩尔质量大的有机 物，主要采用高效液相色谱法进行分离和分 析 ② 流动相作用： 气相色谱法的流动相是惰性气体，仅起运载 作用 高效液相色谱法中流动相不仅起运载作用，还与固定相一起共同完成对组分的分离 ③运行环境： 气相色谱法一般都在较高温度下进行分离和测定，使其应用范围受到了较大的限制。 高效液相色谱一般在室温下进行分离和分析，适于分离分析生物大分子、离子型化合物、不稳定的天然产物和各种高分子化合物如：蛋白质、氨基酸、核酸、多糖类、植物色素、高聚物、染料、药物等。 ④HPLC除用于分离和分析外，还可用于制备 注意：由于气相色谱更快、更灵敏、更方便而且耗费低，因此凡是能用气相色谱法分析的样品一般不用液相色谱法。 二、高效液相色谱法的类型 高效液相色谱法可以分为： 液液分配色谱法（LLPC） 液固吸附色谱法(LSAC) 离子交换色谱法（IEC） 离子对色谱法（IPC） 离子色谱法（IC） 空间排阻色谱法（SEC） 亲和色谱法（AC） 三、正相色谱法 Normal phase HPLC 正相色谱法的流动相极性小于固定相。样品中极性小的组分先流出，极性大的后流出。正相色谱法适于分析极性化合物。 氰基键合相以氰乙基取代了硅胶的羟基，极性比硅胶小，选择性与硅胶相似，它主要用于可诱导极化的化合物和极性化合物的分析。 氨基键合相以氨基取代了硅胶中的羟基，其选择性与硅胶有很大的不同，主要用于分析糖类物质。 总之，正相键合相色谱法适于分析中等极性的化合物如脂溶性维生素、甾族、芳香醇、芳香胺、脂和有机氯农药等。 四、反相色谱法 Reversed phase HPLC 反相色谱法的流动相极性大于固定相，极性大的组分先流出色谱柱，极性小者后流出，适于分析非极性化合物。 现用得最多的是反相键合相色谱法。典型的反相键合相色谱是在ODS柱上，采用甲醇－水或乙腈－水作流动相，分离非极性或中等极性的化合物如同系物、绸环芳烃、药物、激素、天然产物及农药残留等。 5.正相色谱与反相色谱法比较 (1) Normal phase HPLC nonpolar solvent /polar column (2) Reversed phase HPLC polar solvent /nonpolar column (3) Normal- (polar column) versus Reversed Phase (nonpolar) elution: (4)Reversed-phase HPLC most common (high polarity solvent, high polarity solutes elute first) R is C8 or C18 hydrocarbon (4) Stationary Phase Choice Choose column with similar polarity to analyte for maximum interaction Reversed-phase column (nonpolar) R hydrocarbon Normal-phase column (polar) R cyano (C2H4CN) 氰基柱 most polar diol (C3H6OCH2CHOHCH2OH) amino (C3H6NH2) 氨基柱 least polar (5)Mobile Phase Choice Polar (strong) solvent interacts most with polar analyte (solute) –elutes faster but less resolution Strength characterized by polarity index P ranges from -2 (nonpolar) to 10.2 (highly polar) in a mixture PAB = φAPA + φ BPB fraction in mixture In HPLC, capacity factor k can be manipulated by cha