酵 母 表 达 系 统 酵母表达系统 基因表达是分子生物学领域的重要内容 .doc

酵母表达系统基因表达是分子生物学领域的重要内容之一，人们利用基因表达技术制备各种目的基因的重组蛋白质，在分析基因的表达与调控、基因的结构与功能、基因治疗以及生物制药等领域均取得了令人振奋的成果。其中，酵母表达系统拥有转录后加工修饰功能，操作简便，成本低廉，适合于稳定表达有功能的外源蛋白质，而且可大规模发酵，是最理想的重组真核蛋白质生产制备用工具。1、酵母表达系统的特点 酵母是一种单细胞低等真核生物，培养条件普通，生长繁殖速度迅速，能够耐受较高的流体静压，用于表达基因工程产品时，可以大规模生产，有效降低了生产成本。酵母表达外源基因具有一定的翻译后加工能力，收获的外源蛋白质具有一定程度上的折叠加工和糖基化修饰，性质较原核表达的蛋白质更加稳定，特别适合于表达真核生物基因和制备有功能的表达蛋白质。某些酵母表达系统具有外分泌信号序列，能够将所表达的外源蛋白质分泌到细胞外，因此很容易纯化。 应用酵母表达系统生产外源基因的蛋白质产物时也有不足之处，如产物蛋白质的不均一、信号肽加工不完全、内部降解、多聚体形成等，造成表达蛋白质在结构上的不一致。解决内部降解的方法有三：一是在培养基中加入富含氨基酸和多肽的蛋白胨或酪蛋白水解物，通过增加酶作用底物来缓解蛋白水解作用；二是将培养基的pH值调成酸性(酵母可在pH3.0~8.0的范围内生长)，以抑制中性蛋白酶的活性；三是利用蛋白酶缺失酵母突变体进行外源基因的表达。另外，还时常遇到表达产物的过度糖基化情况。因此，表达系统应根据具体情况作适当的改进。 2、常用酵母表达系统(宿主-载体系统) （1）酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)表达系统 酿酒酵母难于高密度培养，分泌效率低，几乎不分泌分子量大于30 kD的外源蛋白质，也不能使所表达的外源蛋白质正确糖基化，而且表达蛋白质的C端往往被截短。因此，一般不用酿酒酵母做重组蛋白质表达的宿主菌。酿酒酵母本身含有质粒，其表达载体可以有自主复制型和整合型两种。自主复制型质粒通常有30个或更多的拷贝，含有自动复制序列(automaticreplicating sequence，ARS)，能够独立于酵母染色体外进行复制 ，如果没有选择压力，这些质粒往往不稳定。整合型质粒不含ARS，必需整合到染色体上，随染色体复制而复制。整合过程是高特异性的，但是拷贝数很低。为此，人们设计了pMIRY2(for multiple integration into ribosomal DNin yeast)质粒，旨在将目的基因靶向整合到rDNA簇上(rDNA簇为酵母基因组中串联存在的150个重复序列)，因此利用pMIRY2质粒可以得到100个以上的拷贝。值得注意的是，酿酒酵母表达的外源蛋白质往往被高度糖基化，糖链上可以带有40个以上的甘露糖残基，糖蛋白的核心寡聚糖链含有末端仅1,3甘露糖，产物的抗原性明显增强。所以，酿酒酵母常常用来制备亚单位疫苗(如HBV疫苗、口蹄疫疫苗等)。 （2）甲醇营养型酵母表达系统? 甲醇营养型酵母包括汉森酵母属(Hansenula)，毕赤酵母属(Pichia)，球拟酵母属(Torulopsis)等，能在以甲醇为唯一能源和碳源的培养基上生长，甲醇可以诱导它们表达甲醇代谢所需的酶，如醇氧化酶I(AOX1)，二羟丙酮合成酶(DHAS)、甲酸脱氢酶(FMD)等。AOX1的甲醇诱导表达量可占胞内总蛋白质的20％~30％，表明AOX1的合成受转录水平的调控。AOX1启动子(PAox )具有较高的调控功能，可用于外源基因的表达调控。甲醇营养型酵母表达系统以巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统最为常用，它由野生型石油酵母Y11430突变而来，常用的3株宿主菌是GS115，KM71 和 MC10-3。GS115和KM71是Y11430的组氨醇脱氢酶基因(histidinol dehydrogenase gene，hs4)缺失突变体，不能合成 Hs4，因此质粒载体需携带hs4，转染后的阳性重组子可以用hs4缺陷 (hs4-)平板进行筛选，但是GS115和KM71存在一定的低频率自发回变，即重新变为hs正常菌株，致使hs-平板筛选阳性重组子存在假阳性情况。GS115的启动子为P，在含甲醇的培养基中可以快速生长。KM71的启动子为P，除了hs4-外，其精氨酰琥珀酸裂解酶基因(argininosuccinate lyase gene，arg4)也被缺失突变，不能在缺乏Arg的培养基上生长。KM71的基因型为hs4- arg4-，由于野生型AR4基因插入截断了OX1，KM71只有依赖较弱的AOX2基因进行甲醇代谢，生长速度较为缓慢。MC0-3的两个AOX基因都被剔除，其基因型为 his4 arg4-ARG4-AOX2-，完全不能在含甲醇的培